微生物过氧化氢酶的发酵生产及其在纺织工业的应用

张东旭，堵国成,，陈坚

1 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

2 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122

综 述

微生物过氧化氢酶的发酵生产及其在纺织工业的应用

张东旭1，堵国成1,2，陈坚2

1 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

2 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122

微生物过氧化氢酶是一种重要的工业酶制剂，可以催化分解过氧化氢生成水和氧气。这一酶制剂在食品、纺织、医药等领域表现出广泛的应用潜力。生物工程和基因工程技术的进步推动了微生物过氧化氢酶的发酵生产。以下综述了微生物过氧化氢酶发酵生产的进展及其在纺织工业中的应用，同时讨论了微生物过氧化氢酶的发酵生产和纺织工业应用的未来趋势。

微生物过氧化氢酶，发酵，纺织，应用

Abstract:Microbial catalase is an important industrial enzyme that catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide to water and oxygen. This enzyme has great potential of application in food, textile and pharmaceutical industries. The production of microbial catalase has been significantly improved thanks to advances in bioprocess engineering and genetic engineering. In this paper, we review the progresses in fermentation production of microbial catalase and its application in textile industry. Among these progresses, we will highlight strain isolation, substrate and environment optimization, enzyme induction, construction of engineering strains and application process optimization. Meanwhile, we also address future research trends for microbial catalase production and its application in textile industry. Molecular modification (site-directed mutagenesis and directed revolution) will endue catalase with high pH and temperature stabilities. Improvement of catalase production, based on the understanding of induction mechanism and the process control of recombinant stain fermentation, will further accelerate the application of catalase in textile industry.

Keywords:microbial catalase, fermentation, textile, application

1 过氧化氢酶简介

过氧化氢酶 (Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas不存在过氧化氢酶[1-4]。除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶[5]。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为3个亚群，即单功能过氧化氢酶 (Monofunctional catalase or Typical catalase)、双功能过氧化氢酶 (Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶 (Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由 4个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团[6]。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4个紧密结合的NADPH分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生 (主要为SOD歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton和Harber-weiss反应产生·OH。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化[7]。

人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100多年前，早在1811年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892年Jacobson证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901年Loew第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性[8]。到1937年，Sumner和Dounce首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一[9]。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低，在上述组织细胞内过氧化氢酶主要与细胞器如线粒体和过氧化物酶体结合的形式存在，而在红细胞中则以可溶的状态存在[10]。

过氧化氢酶来源丰富，存在于几乎所有好氧生物中和一部分厌氧生物中。动物过氧化氢酶存在于动物的主要组织中，尤以肝与红细胞为最多，脑、心脏与骨骼肌为最少，动物肝脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化生产。另外，巴西研究者开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术。植物方面，主要集中在过氧化氢酶保护植物抗氧化机理方面的研究[10]。不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏以及细菌的过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶，实现高产和提取均不方便。酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶[11-12]。因此选用嗜热丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面具有较大优势。此外也有研究通过构建基因工程菌来生产过氧化氢酶[13]。目前商业化的过氧化氢酶以动植物提取和微生物发酵生产为主，本文将重点讨论微生物来源的过氧化氢酶的生产。

自20世纪80年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经开始使用过氧化氢代替有毒的氯气来漂白和消毒产品。过氧化氢可用于消除新鲜水果和蔬菜上有害的细菌，如沙门氏菌和大肠杆菌，还可用于消毒奶制品，为食品的纸包装如果汁盒消毒也不必冷藏储存等。在去除生产过程中剩余的过氧化氢的过程中，人们将注意力转向了具有非常高的催化效率的过氧化氢酶，因此过氧化氢酶在食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。目前过氧化氢酶主要的应用领域包括：1) 临床。在临床分析中，过氧化氢酶对研究自由基代谢失衡、抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断、鉴别诊断亦具有重要意义[12,14]。过氧化氢酶可消除过氧化氢，对超氧化物歧化酶起保护作用，因而具有抗衰老作用[15]。2) 医药。由于过氧化氢具杀菌、清洁、漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。如在隐形眼镜消毒过程中添加过氧化氢酶可分解消毒液中残留的过氧化氢。国内、外均有研究的专利发表[16-18]。3) 食品加工。过氧化氢酶可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。此外过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶并用作为氧的去除剂，还可用于牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌[19]。4) 其他工业。与过氧化氢同时使用，用于橡胶成型、塑料及多泡性粘合剂。纸浆、纤维、毛漂白工艺中除残留的过氧化氢。加入化妆品中可防止皮肤衰老，还可处理半导体废水。近年来随着过氧化氢在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求也呈大幅增长趋势。本文将重点讨论过氧化氢酶在纺织工业中的应用。

2 微生物过氧化氢酶的发酵生产和性质

微生物过氧化氢酶是目前研究的热点。除生理机理研究外，工业开发方面也进行了更深入的研究，国外继黑曲霉和微溶壁球菌产过氧化氢酶分别实现工业化生产之后，又开发了产酶性能更佳的嗜热子囊菌、芽胞杆菌、重组大肠杆菌等微生物菌种。国内用微生物生产过氧化氢酶仍停留在研究开发阶段。现在市售商品过氧化氢酶基本为牛肝过氧化氢酶和微生物产过氧化氢酶共存，微生物产过氧化氢酶基本由诺维信、有田酵素、杰能科等大公司控制。

2.1 微生物过氧化氢酶的野生菌株生产

微生物过氧化氢酶发酵研究最早可追溯到1951年，Brizuela等首次报道了用杆菌Bacillus发酵生产过氧化氢酶[20]。后来，研究者不断筛选出新的过氧化氢酶生产菌株，同时发展出各种优化发酵过程的方法。表1列举了近年来在微生物过氧化氢酶方面取得的进展。由于过氧化氢酶在微生物中普遍存在，生物多样性赋予了微生物多种可能的过氧化氢酶合成、分泌和调控机制，因此通过菌种筛选提高发酵水平是一种十分有效手段。到目前为止，至少筛选出8种产过氧化氢酶的微生物，如变幻青霉Penicillum variabile、黑曲霉Aspergillus niger、酿酒酵母Saccharomyces cereisiae、葡萄球菌Staphylococcus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeiktious、嗜热囊菌Thermoascus aurantiacus、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacte等 (表1)。目前最高的过氧化氢酶发酵水平是在枯草杆菌中获得的，最高产量达到18 000 U/mL，生产强度可以达到 1 000 U/(mL·h)[21]。

除菌种筛选外，培养条件优化 (pH、温度、溶氧等) 和培养基优化等手段也运用到微生物过氧化氢酶的发酵中，过氧化氢酶的发酵水平不断提高(表 1)。例如，赵志军等通过培养基优化，使过氧化氢酶产量从30 U/mL提高到3 258 U/mL[23]。邓宇等通过氮源优化，使酶活从3 000 U/mL提高到11 000 U/mL[22]。经过50多年的努力，研究者将过氧化氢酶的发酵水平从78 U/mL提高到18 000 U/(mL·h)，生产强度从 0.1 U/(mL·h) 提高到 1 000 U/(mL·h)。但随着菌种筛选工作的不断开展，从自然界直接筛选获得产酶水平大幅提升的微生物的几率越来越小，这就要求研究者通过基因工程手段定向的构建能够高产过氧化氢酶的微生物。

表1 提高微生物过氧化氢酶产量的不同方法比较Table 1 Comparison of different methods to improve the production of microbial catalase

2.2 基因工程菌构建

为了进一步提高微生物过氧化氢酶的产量，研究者尝试构建基因工程菌来高效生产过氧化氢酶。Furuta等在1990年首次报道了以大肠杆菌为宿主构建产过氧化氢酶的基因工程菌，基因来源是小鼠肝脏细胞，但获得的产量不高[31]。接下来科学家尝试了各种来源的过氧化氢酶基因和表达宿主 (表 2)。到目前为止，毕赤酵母Pichia pastoris、结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis、多形汉逊酵母Hansenula polymorpha、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis等已作为生产基因工程过氧化氢酶的宿主，过氧化氢酶基因的来源也拓展到稻瘟病菌Magnaporthe grisea、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、嗜冷杆菌Psychrobacte、人体细胞、嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae等来源 (表 2)。

表2 采用基因工程菌发酵生产过氧化氢酶情况Table 2 Milestones in microbial catalase production by genetically modified strains

目前获得最高发酵水平的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，最高产量 11 000 U/mL，生产强度为458 U/(mL·h)，发酵水平与使用野生菌生产过氧化氢酶相比仍有一定的差距[34]。目前基因工程过氧化氢酶的研究主要集中在工程菌的构建，缺乏发酵过程控制和优化的研究，如前期生长阶段的高密度培养和后期产酶阶段的持续稳定诱导策略的研究。过程控制和优化方面的研究，将进一步推动基因工程过氧化氢酶生产水平的提高。此外，微生物过氧化氢酶是一种诱导酶，通过对高产过氧化氢酶微生物中酶的诱导、合成、分泌机制的研究，将有助于提高过氧化氢酶基因工程菌的构建水平。

2.3 过氧化氢酶与胁迫物的关系及诱导产酶

过氧化氢酶可由过氧化氢等诱导物诱导表达[1,38-40]。表3列出了几种典型微生物在过氧化氢和O2−胁迫下抗氧化物酶的表达情况。可以看出，过氧化氢酶是各种微生物细胞 (特别是对于Bacillus属的微生物) 抵抗活性氧胁迫最主要的抗氧化物酶。

表3 过氧化氢和O2−胁迫下不同微生物的抗氧化酶合成情况Table 3 Synthesis of antioxidative enzymes in different microbe under H2O2and O2−stress

由于活性氧消耗了胞内的还原力，因此在活性氧胁迫下六磷酸葡萄糖脱氢酶 (Glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD) 的活性也得到了提高，G6PD的作用是提供维持细胞内氧化还原环境平衡的还原力NADPH。在微生物氧化应激研究中，还发现一些新表达的蛋白，其生理作用目前还不是很清楚，但从已经确定的来看，大多是一些控制抗氧化酶转录和表达的调控因子[21,42]。

过氧化氢酶作为微生物体内专一清除过氧化氢的抗氧化物酶，其合成受到底物 (过氧化氢) 的直接诱导。已有的研究表明，过氧化氢对过氧化氢酶诱导作用主要取决于其浓度，一般来说，低浓度过氧化氢诱导过氧化氢酶合成，过氧化氢酶立即分解过氧化氢，以消除过氧化氢对细胞的继续毒害，同时提高了细胞对过氧化氢胁迫的抵抗能力[46]。但当过氧化氢浓度超过过氧化氢酶的分解能力或过氧化氢酶来不及分解过氧化氢时，过氧化氢及其产物 OH·会不加选择地攻击细胞成分，引起细胞代谢紊乱，抑制细胞生长，导致过氧化氢酶合成水平降低。更为重要的是 OH·本身会直接攻击过氧化氢酶活性中心导致过氧化氢酶失活，破坏细胞的防御系统，加剧氧自由基对细胞的氧化损伤[47]。另外，过氧化氢对过氧化氢酶合成的诱导作用还取决于胁迫方式，Janero等发现连续添加非致死浓度的过氧化氢能够刺激肌原细胞 (Cardiacmyocytes) 过氧化氢酶的合成，而一次性添加较高浓度 (25 µmol/L) 的过氧化氢却不能诱导过氧化氢酶合成[48]。

由于 O2−诱导超氧化物歧化酶合成的同时会产生过氧化氢，因此在O2−胁迫下过氧化氢酶也会有不同程度的提高[4,40]。另有研究表明，一些环境因素如温度、盐胁迫也能够诱发胞内O2−的产生从而提高过氧化氢酶合成水平。Bai等发现在黑曲霉Aspergillus niger生长的对数期或稳定期提高培养温度 (25℃～35℃)，胞内活性氧浓度增加了 1.3倍和 2.8倍，从而诱导了过氧化氢酶合成[49]。过氧化氢胁迫对过氧化氢酶合成的影响除了与微生物种类、过氧化氢浓度和胁迫方式有关外，还与细胞生理状态 (不同生长时期)、营养环境条件等因素相关[50]。表 4列举了通过诱导或胁迫促进野生菌发酵生产过氧化氢酶的方法。例如，姚丹丹等使用枯草芽胞杆菌作为生产菌株，通过过氧化氢和乙醇诱导，使过氧化氢酶产量从11 000 U/mL提高到23 000 U/mL，生产强度从 360 U/(mL·h) 提高到 640 U/(mL·h)[51]。可见，通过添加活性氧、过氧化氢、甲醇等物质进行诱导或胁迫产酶，对过氧化氢酶野生菌而言是一种十分有效的提高微生物产量的方法。此外，过氧化氢酶的胁迫机制也提醒我们，基因工程菌中过量表达的过氧化氢酶可能会影响到宿主菌自身对环境氧胁迫的响应。例如过量合成的过氧化氢酶会降低宿主细胞的氧胁迫水平，这时如果通过发酵控制提高环境的溶氧水平，将在不伤害细胞的前提下促进生长和代谢速率。

2.4 不同微生物来源的过氧化氢酶的性质比较

不同来源的过氧化氢酶的热、碱稳定性往往不同。在纺织热漂去除过氧化氢时，温度和pH均较高(60℃左右，pH约为11)，要求使用的过氧化氢酶必须有较高的耐热和耐碱特性[55]。表5比较了不同来源的过氧化氢酶的 pH和温度稳定范围，其中碱性芽胞杆菌Alkaliphilic Bacillus、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacter和嗜热子囊菌Thermoascus aurantiacus来源的过氧化氢酶，pH稳定范围在碱性范围 (pH＞8.0)，枯草芽孢杆菌、放射型根瘤菌、嗜热子囊菌来源的过氧化氢酶温度稳定范围较高 (＞50℃)，较适合在纺织工业中应用[23,56-58]。

表4 诱导和胁迫提高微生物过氧化氢酶产量Table 4 Improvement of Catalase production by Induction and stress

目前市场上商品化过氧化氢酶中，动物肝脏提取的过氧化氢酶的pH应用范围一般在6.0～8.0，温度应用范围在30℃～50℃；微生物发酵的过氧化氢酶的 pH应用范围在 6.0～9.0，温度应用范围在30℃～65℃。市场上过氧化氢酶的pH和温度稳定范围仍有进一步提升的需要。一方面，可通过菌种筛选，进一步获得耐高温、高碱的过氧化氢酶；另一方面，可通过分子生物学手段对过氧化氢酶分子进行改造，如通过定点突变、定向进化等方法，提高过氧化氢酶的温度稳定性和高pH耐受性。

表5 不同来源过氧化氢酶的性质比较Table 5 Characteristics of catalases from different resources

3 过氧化氢酶在纺织工业的应用

纺织工业是我国的传统产业和支柱产业，也是污染非常严重的工业，尤其是在印染加工过程中，传统工艺耗费大量的水和化学品，不仅耗费资源，同时还造成环境污染，破坏生态平衡。这对实施可持续发展战略是极为不利的。因此随着世界范围内，水的消耗和废水处理变得越来越昂贵，大多数染色和整理工厂正非常密切地关注着减少水的消耗和废水排放的节约潜力。要从根本上改变纺织工业高消耗、高污染的传统粗放型经济增长方式，必须大力推动和发展纺织工业清洁生产技术，实现纺织工业污染防治由“末端治理”向“源头预防”的转变。

纺织品染整加工中，经过氧化氢漂白后进入染色步骤，染浴中若存在过氧化氢，会造成对氧化敏感的活性染料褪色，即使染料分子较小的改变都会导致色泽的消失。由于严格的质量要求，染色织物上有微小的色泽改变，在商业上都不能接受。因此漂白过程一旦结束，为保证后道染色的安全性，必须将氧漂后残留的过氧化氢去除干净，以避免在其后的染色过程发生问题。传统工艺采用水洗或化学还原剂去除过氧化氢，需多次升温、洗涤，并可能带入有毒和难降解的物质。使用过氧化氢酶去除过氧化氢反应速率非常快：在最适条件下，每摩尔过氧化氢酶在1 min内可分解5×106摩尔过氧化氢。在染整工艺中使用过氧化氢酶替代多次清洗及化学还原剂去除漂白液中残留的过氧化氢，具有很大的经济优势和环保优势[10-11,59]。

冷晒祥等使用过氧化氢酶的酶解工艺代替传统工艺，可以使去除过氧化氢的时间缩短1/3，用水量减少 2/3[60]。Paar等研究了过氧化氢替代传统工艺的应用条件，发现使用固定化过氧化氢酶可以显著提高织物漂白处理后的染色性能[61]。张瑞萍等用过氧化氢酶代替传统的高温除过氧化氢工艺，保证了后道染色的色光和染色重现性，并且节约能源，提高生产效率[62]。何照兴等采用过氧化氢酶生物除H2O2，达到了节省水、电、汽用量，降低成本，提高生产效率，并减少对环境的污染效果[63]。这些研究表明过氧化氢酶处理替代传统化学除H2O2，工艺简便易行、处理效果显著，非常适合在纺织工业推广。

尽管过氧化氢酶具有高效、环保、处理效果显著等优点，但是其高昂的价格、在工业应用中容易失活以及pH、温度适应范围较窄等问题也阻碍着其在纺织工业的大规模应用。长期来看，随着人们环保意识的加强和排污成本的提高，将会促进过氧化氢酶在纺织业的应用规模。短期来看，一方面可通过提高发酵水平降低成本，另一方面可通过分子改造提高过氧化氢酶耐受高温和强碱的能力和稳定性，减少酶的用量来降低成本。此外，研究和开发新的、更加高效和低消耗的过氧化氢酶应用工艺，也将促进过氧化氢酶在纺织工业大规模推广应用。

4 结论与展望

综上所述，过氧化氢酶作为一种新型酶制剂，在棉织物的前处理工艺中起着重要的作用，纺织热漂步骤使用过氧化氢酶是实现纺织工业节能减排和可持续发展的有效方法。目前商品化过氧化氢酶的价格较高，温度和pH耐受范围较低，这些都制约着过氧化氢酶在纺织工业的大规模应用。过氧化氢酶发酵生产目前的研究主要集中在菌种筛选、培养基和发酵条件优化、基因工程菌构建等方面，发酵水平仍需进一步提高。考虑到纺织加工处理的条件需要，需要开发出更加适应高温和碱性条件的过氧化氢酶用于过氧化氢漂白后的酶处理。因此，未来的研究重点将围绕以下几个方面进行：1) 通过菌种筛选，获取高产和能耐受高pH、高温度的过氧化氢酶的菌株。通过野生菌发酵过程控制与优化，提高发酵产量。同时对编码耐高温、高碱过氧化氢酶的基因进行鉴定。2) 从耐高温高碱过氧化氢酶基因出发构建工程菌，结合现代在线控制与分析技术，进行过氧化氢酶发酵过程优化与控制研究，提高产酶水平。3) 通过定点突变、定向进化等分子改造手段，提高过氧化氢酶的温度、pH耐受性，提高其应用性能。

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Fermentation production of microbial catalase and its application in textile industry

Dongxu Zhang1, Guocheng Du1,2, and Jian Chen2

1Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China

Received:March 22, 2010;Accepted:May 6, 2010

Supported by:Program for New Century Excellent Talents in University (No. NCET-07-0378), Key Technologies Research and Development Program of Jiangsu Province, China (No. SBE200900022), National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 20625619), National Basic Research Prgram of China (973 Program) (No. 2007CB714306).

Corresponding author:Jian Chen. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn

教育部新世纪优秀人才支持计划 (No. NCET-07-0378)，江苏省科技支撑计划 (No. SBE200900022)，国家杰出青年基金 (No. 20625619)，国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2007CB714306) 资助。