HPLC测定青蒿植株不同部位的东莨菪内酯含量

吴蜀瑶，李敏，王佳黎

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

质量标准

HPLC测定青蒿植株不同部位的东莨菪内酯含量

吴蜀瑶，李敏*，王佳黎

(成都中医药大学，四川 成都 611137)

目的：建立高效液相色谱法测定青蒿中东莨菪内酯的含量，并对青蒿植株不同部位的东莨菪内酯的含量进行比较。方法：Kromasil ODS-1色谱柱(250mm×4.6mm)，甲醇-水(40∶60)为流动相，测定波长：344nm，流速：0.8mL·min-1，柱温：25℃，进样量：15μL。结果:东莨菪内酯在0.077 5～0.31μg呈良好线性关系，r=0.999 9，平均回收率为99.74%，RSD=2.33%。结论：该方法灵敏度高，准确度和稳定性较好，测定方法可靠，可用于青蒿中东莨菪内酯的含量测定。测定结果表明，青蒿各部位的含量依次为：叶>花>根>子>茎。

青蒿；高效液相色谱法；东莨菪内酯

青蒿来源于菊科植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分[1]，其味苦、辛，性寒，具清热解暑，除蒸，截疟功能。临床上用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸[2]。除青蒿地上部分外，《本草纲目》青蒿条下亦收载有青蒿根及青蒿子，谓其根“苦、寒、无毒”，“青蒿子甘、冷、无毒。功用和青蒿叶相同。”此外，《江苏省中药材标准》(1989年版)也收载了青蒿子。另外，古代医药方书中有一些单方或复方使用青蒿根及子治疗多种疾病的记载。

据文献报道，青蒿中的香豆素类成分主要有东莨菪内酯、香豆素等。而东莨菪内酯具有抗炎、镇痛、祛痰、平喘等药理作用，为青蒿的有效成分之一[3，4]。本文以东莨菪内酯为指标性成分，建立高效液相色谱法测定青蒿中东莨菪内酯的含量，并比较青蒿不同植株部位中该成分含量的差异，不仅对青蒿药材和制剂的质量控制提供了科学依据，同时也为扩大黄花蒿的药用资源提供了参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Varian高效液相色谱仪；KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP121S电子天平(德国赛多利斯股份公司)；DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 试药

HPLC用甲醇为色谱纯，水为纯净水；其余试剂均为分析纯。东莨菪内酯对照品(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号110768-200504)。

青蒿药材采自四川省安岳县青蒿基地，经成都中医药大学李敏教授鉴定为菊科植物黄花蒿ArtemisisaannuaL.的干燥全株。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil ODS-1(250mm×4.6mm)；流动相：甲醇-水(40∶60)；测定波长：344nm；流速：0.8mL·min-1；柱温：25℃；进样量：15μL。在该条件下，东莨菪内酯色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数按东莨菪内酯峰计算为3 000以上。

2.2 对照品溶液制备

精密称取东莨菪内酯对照品15.5mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(0.155mg·mL-1)。临用前精密量取1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.015 5mg·mL-1的对照品溶液。

2.3 线性范围的考察

分别吸取上述0.015 5mg·mL-1的对照品溶液5，10，12.5，15，20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定其峰面积。以东莨菪内酯进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=37 649 520.0X+1 202 600.1，r=0.999 9。结果表明，东莨菪内酯在0.077 5～0.31μg呈良好线性关系，对照品色谱图见图1。

A.东莨菪内酯对照品 B.叶 C.花 D.茎 E.子 F.根图1 东莨菪内酯对照品及青蒿HPLC图

2.4 供试品溶液制备方法的考察和确定

本次实验对提取过程中影响提取效率的提取方式、提取溶剂、溶剂体积三因素进行考察。实验结果以东莨菪内酯含量为指标，选用青蒿全株进行样品制备，按照L9(34)正交表进行实验。实验结果表明，以超声60min、甲醇15mL提取为供试品的最佳提取方案，即：取药材粉末约0.25g(平行2份)，精密称定，置50mL锥形瓶中，精密加入甲醇15mL，称定重量，超声处理60min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，即得。

2.5 精密度试验

精密吸取东莨菪内酯对照品溶液(0.015 5mg·mL-1)15μL注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积值，RSD=0.98%，说明该方法精密度良好。

2.6 重复性试验

按照拟定的方法，取同一样品，平行6份，制备成供试品溶液，进样15μL，测得峰面积，并计算东莨菪内酯的含量。平均含量为0.819 8mg·g-1，RSD=1.05%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

按照拟定的方法制备供试品溶液，室温密闭保存，分别于0,1,2,4,8,10h进样15μL，计算样品中的东莨菪内酯峰面积值，RSD=1.62%。试验表明，供试品溶液可在室温下密闭保存10h，不影响测定结果。

2.8 回收率试验

取同一已知含量的青蒿全株样品粉末9份，每份约0.10g，精密称定，分别精密加入东莨菪内酯对照品(0.155mg·mL-1)0.4,0.4,0.4,0.6,0.6,0.6,0.8,0.8,0.8mL，按照已确定的方法制备供试品溶液并依法测定,结果见表1。

表1 东莨菪内酯加样回收试验

回收率试验结果表明，3种水平9次试验的加样回收率测得结果均在95%～105%，说明东莨菪内酯的提取和检测方法可行。

2.9样品的含量测定

取青蒿叶、花、茎、根、子药材各约0.25g，平行两份(n=2)，精密称定，按上述含量测定方法进行测定，结果见表2，色谱图见图1。

表2 青蒿子、叶、花、茎、根的含量测定 /mg·g-1

3 讨论

通过紫外分光光度计对东莨菪内酯对照品的甲醇溶液，在200～400nm波长进行扫描,结果发现，东莨菪内酯在255nm,260nm以及344nm处均有吸收峰，由于在前两者的波长下干扰峰较多，分离度较差，而在344nm处灵敏度高，杂质干扰小，故选择344nm为含量测定的波长。

在对供试品溶液提取方法进行正交试验时，确定了3个对提取方法产生主要影响的因素，其中提取方式选用了超声60min、回流60min、温浸(45℃，10h)3个水平，提取溶剂选用甲醇、85%甲醇、95%乙醇3个水平，提取溶剂的体积选用10，15，20mL 3个水平进行正交试验。另外，由于曾做过超

声40，60，80min的单因素考察，发现供试品溶液在60min时已基本提取完全，故未将提取时间再列入因素表进行考察。

本实验建立了青蒿中东莨菪内酯的HPLC含量测定方法，通过方法学考察表明，该方法灵敏度高，准确度和稳定性较好，测定方法可靠。用该方法测定的结果为：青蒿叶中东莨菪内酯的含量最高，达1.210 6mg·g-1，而青蒿茎的含量最低，仅为0.082 7mg·g-1，青蒿叶中东莨菪内酯含量约为茎中含量的14倍。

[1] 肖培根.新编中药志(第三卷)[M].北京：化学工业出版社，2001：154.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(精选本)[M].上海：上海科学技术出版社，1998：1851.

[3] 杨岚，王满元，张东，等.青蒿药材中东莨菪内酯的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2006，12(10)：10-11.

[4] 陈玉敏，曹红，周苏萍.高效液相色谱法测定丁公藤中东莨菪内酯的含量[J].中成药，2005，27(12)：1461-1462.

DeterminationofScopoletineinDifferentPartsofQinghaobyHPLC

Wu Shuyao, Li Min, Wang Jiali

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,ChengduSichuan611137,China)

Objective: To establish HPLC method for the determination of Scopoletine in Qinghao and analyze Scopoletine contents in differdnt parts of Qinghao.Methods: Scopoletine in Qinghao was determined by HPLC with Kromasil ODS-1 column(250mm×4.6mm).The mobile phase was methanol-water(40∶60). The detection wavelength was 344nm. The column temperature was 25℃, the flow rate was 0.8mL·min-1, and the sampling volume was 15μL.Results: The linearity of Scopoletine was good in range of 0.077 5～0.31μg (r=0.999 9). The average recovery was 99.74%, RSD was 2.33%.Conclusion: The method is simple, accurate, repeatable and suitable for the determination of Scopoletine in Qinghao. The results show that the contents of Scopoletine in different parts of Qinghao are: leaf>flowers> roots> fruit> stems.

Artemisia annua; HPLC; Scopoletine

*李敏，E-mail：028limin@163.com

2010-03-24)