细菌发酵产黄姜薯蓣皂苷元的分离纯化

王 亚 南， 富 瑶 瑶， 王 颖， 鱼 红 闪， 金 凤 燮

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

黄姜又名盾叶薯蓣[1]，主要活性物质为薯蓣皂苷，其学名为3-O-α-L-鼠李糖-(1→4)-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-薯蓣皂苷元[2]，是生产甾体激素类药物原料，常用于治疗风湿关节炎、心脑血管疾病等[3-4]。由于薯蓣皂素的需求量非常大，现有的传统加工工艺采用黄姜全料酸解，使用的盐(硫)酸量大，造成污水量大，COD浓度高，并且酸降解的有机物质多，对环境造成重大污染，因而使用生物法酵解皂苷生产皂素已成为发展趋势。刘冰[5]、王元好[6]等分别用真菌sp.D00b、sp.D38b来源的薯蓣皂苷酶在植物体外水解穿山龙薯蓣皂苷，并对酶解产物进行了分离纯化，得到3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-薯蓣皂苷元。作者采用细菌Rhodopseudomonassp.No.18直接对黄姜生药进行发酵，转化黄姜中的薯蓣皂苷得到薯蓣皂素和低糖基薯蓣皂苷，并对发酵产物进行分离、纯化和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

黄姜薯蓣皂苷发酵产物，实验室自制；薯蓣皂苷及薯蓣皂苷元标准品，产地陕西；细菌Rhodopseudomonassp.No.18，韩国KAIST大学提供；薄层层析板；硅胶。

1.2 方 法

1.2.1 黄姜薯蓣皂苷发酵产物的制备

将黄姜与水按1∶1比例均匀混合，灭菌后接入Rhodopseudomonassp.No.18菌，在30 ℃下进行发酵培养4 d。发酵结束后用3倍体积的石油醚对发酵培养基进行脱脂，滤掉石油醚；待培养基中残留石油醚挥发完全后，向培养基中加入4倍体积的水饱和正丁醇，24 h后过滤，收集滤液。水饱和正丁醇反复提取3次，滤液浓缩干燥即获得黄姜薯蓣皂苷发酵产物。

1.2.2 硅胶柱层析法分离黄姜薯蓣皂苷发酵产物

样品胶的制备：将黄姜薯蓣皂苷发酵产物溶于甲醇，待完全溶解后，缓慢加入适量的80～100目硅胶，不断搅拌，使发酵产物与硅胶结合，置于60 ℃水浴加热，待溶剂完全挥发后即得样品胶。

装柱：取适量300～400目硅胶作为分离胶。将分离胶缓慢装入玻璃柱中，真空吸实，使其铺放均匀。在分离胶上层均匀装入制备好的样品胶，样品胶表面覆盖脱脂棉。装柱过程中要注意保持柱子垂直，以及各层硅胶面的水平。

梯度洗脱：装好的硅胶柱首先通入氯仿通柱，直至色素至分离胶底部,然后依次按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1进行梯度洗脱。分别收集洗脱液，即可得到薯蓣皂苷单体，TLC检测分离结果。洗脱液经减压浓缩，蒸干即得到固态单体。

1.2.3 薄层层析法检测黄姜薯蓣皂苷

在薄层层析板上，用微量点样器吸取标准品，点样于薄层层析板上。每次点样依照样品浓度确定点样量，每次点样后需风干。将点好样品的硅胶板放入层析缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0 cm(切勿将样点浸入展开剂中)，密封盖，待展开至规定距离(一般为4.5 cm)后，取出，吹干溶剂，喷10%H2SO4水溶液后，加热显色。展开剂：V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5(均相)；点样量：2～5 μL。

1.2.4 HPLC方法测定黄姜酶解产物单体的纯度

仪器：高效液相色谱分析仪(Waters Water 490 Programmable UV Detector、Waters 740 Data Module)；色谱柱：Hypersil(R) ODS2反相柱；柱规格：φ4.6 mm，200 mm；填料：C18，5 μm ；进样量：10 μL；流动相，V(乙腈)∶V(水)=7∶3；均为色谱纯。将所需流动相按要求比例配比，即取乙腈350 mL，超滤水150 mL(超滤膜、真空泵抽滤)，混合均匀，用超声波超20 min除去气泡；检测波长：209 nm；体积流量：1.0 mL/min；柱温：25 ℃。样品预处理：取样品1 mg，溶于1 mL甲醇中。

2 结果与讨论

2.1 黄姜薯蓣皂苷发酵产物的制备

根据“1.2.1”的方法，将黄姜500 g发酵培养4 d。发酵后的培养基经1 500 mL石油醚脱脂后，用2 000 mL水饱和正丁醇反复3次提取发酵产物，收集滤液，浓缩干燥得黄姜薯蓣皂苷发酵产物15.2 g。

2.2 硅胶柱层析法分离黄姜薯蓣皂苷发酵产物

称取黄姜薯蓣皂苷发酵产物10 g放入瓷碗中，倒入适量甲醇，搅拌使固体粉末充分溶解后，与20 g 80～100目的硅胶均匀混合，使黄姜薯蓣皂苷发酵产物被硅胶吸附，置于60 ℃水浴加热，待溶剂挥发尽后即制得样品胶。称取300～400目分离胶200 g，装柱，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶。首先用约500 mL的纯氯仿通柱，然后用V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5的氯仿-甲醇流动相每次200 mL洗脱皂苷，分别收集，TLC法检测。从第3瓶开始皂苷被洗下，至第21瓶时目的产物薯蓣皂苷元几乎全被洗下，此时换用极性稍大的V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1的流动相继续洗脱，至43瓶时产物Ⅱ几乎完全被洗下。最后用甲醇将残余的皂苷完全洗下，TLC 检测结果如图1所示。

S，黄姜薯蓣总皂苷；D，薯蓣皂素；1～48,分离后收集产品的瓶号图1 发酵产物分离纯化检测结果Fig.1 Separation and purification of fermented product on TLC

由图1可以看到，当洗脱液为V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5时，从第3至第17瓶为目的产物薯蓣皂苷元，到21瓶时薯蓣皂苷元已经完全洗脱。此时增加洗脱液极性，当洗脱液为V(氯仿)∶V(甲醇)= 9∶1时，第22瓶开始出现产物Ⅱ，至42瓶时洗脱完全。

收集产物Ⅰ洗脱液(1～17瓶) 浓缩干燥得到晶状粉末2 g，得率为20%，收集产物Ⅱ洗脱液(23～36 瓶)，浓缩干燥后得粉末4.2 g，得率为42%。产物Ⅰ为发酵产物薯蓣皂苷元；产物Ⅱ为分离得到的发酵副产物皂苷单体，其各洗脱液成分、得率见表1。

2.3 高效液相色谱法测定黄姜薯蓣皂苷发酵产物的纯度

取产物Ⅰ1 mg，溶于1 mL色谱甲醇中，采用HPLC法检测产物Ⅰ纯度，结果如图2所示。由图2可知，样品Ⅰ的保留时间为23.097 min，峰面积为6 456 675 μV·s,质量分数为96.9%。由此可知，黄姜薯蓣皂苷元的纯度约为96.9%。

表1 黄姜酵解产物洗脱收集表Tab.1 Prepare for the separation of the product

图2 薯蓣皂苷元的HPLC检测图谱Fig.2 The diosgenin on HPLC

3 结 论

黄姜经细菌直接发酵法制得粗产物15.2 g。黄姜发酵产物10 g经硅胶柱梯度洗脱分离提纯后，得到两种产物。产物Ⅰ为目的产物黄姜薯蓣皂苷元，收集到硅胶柱分离的单点2 g，得率为20%；利用高效液相色谱对其进行纯度测定，层析得到的薯蓣皂苷元纯度为96.9%。产物Ⅱ为反应副产物，收集得4.2 g，得率为42%，其结构、性质及理化作用有待进一步的研究。综上可知，经细菌直接发酵黄姜产薯蓣皂苷元的方法，产物得率不高，其经硅胶柱分离纯化后，各组分分离较完全，所得单体纯度较高。

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[5] 刘冰,王元好,朱宏丽,等. 穿山龙薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化[J]. 大连轻工业学院学报, 2006, 25(3):161-163.

(LIU Bing, WANG Yuan-hao, ZHU Hong-li, et al. Separation and purification of dioscin hydrolysate[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2006, 25(3):161-163.)

[6] 王元好,刘冰,鱼红闪,等. 穿山龙薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化[J]. 大连轻工业学院学报, 2005, 24(1):1-3.

(WANG Yuan-hao, LIU Bing, YU Hong-shan, et al. Separation and purification of dioscin products from enzyme reaction[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2005, 24(1):1-3.)