中性蛋白酶对菜粕品质改良的研究

杨家帅 汤江武 姚晓红 孙 宏 葛向阳

新的研究结果表明，日粮中的蛋白质经消化道内一系列酶的作用，最终是以游离氨基酸和小肽两种形式同时被动物吸收利用，因此，蛋白质的吸收利用并不只是简单地遵循氨基酸平衡的“木桶”理论。蛋白质被分解成小肽后，不仅能以完整形式被动物吸收利用，与游离氨基酸相比，小肽的吸收还具有速度快，耗能低，不易饱和，各种肽之间运转无竞争性与抑制性等特性（胡佐忠，2007）。鉴于小肽具有的特殊的营养和生理作用，小肽的相关研究已成为蛋白质营养领域的研究热点。菜粕有较高的蛋白含量，其氨基酸组成也比较平衡，是一种潜在的、优质的小肽资源。我国有着较丰富的菜粕资源，因此如何使菜粕转化成富含小肽、品质更优、利用率更高的饲用蛋白原料，将对缓解我国养殖业和饲料行业优质蛋白资源的缺乏提供一个新的途径。

酶解法是一种常用的制备多肽、小肽的方法。目前，通过酶解法，利用植物源性蛋白质制备小肽的研究，主要集中在以植物源蛋白的提取物为酶解底物的研究上，而以菜粕固体原料作为底物，直接进行酶解的研究鲜见报道。本研究通过在菜粕固体料中直接添加中性蛋白酶，对菜粕蛋白进行酶解，以期提高菜粕中小肽的含量并降低硫甙的含量，同时对影响酶解效果的因素和条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

菜粕：绍兴中大生物科技有限公司提供，粗蛋白含量≥36%；中性蛋白酶：购自上海博蕴生物科技有限公司，Sigma公司生产，酶活≥10万单位/g；其他常规试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菜粕酶解方法

称取适量菜粕，以一定料水比加入水和酶的混合液，混匀，装入罐头瓶中，用封口膜封口，放入设定温度培养箱中酶解，在实验选取的时间取出，50℃烘干，粉碎，过80目筛待测。

1.2.2 菜粕酶解条件研究

1.2.2.1 酶添加量对小肽含量的影响

称取 50 g 菜粕，分别以 50、75、100、125、150 U/g的添加量，加入中性蛋白酶，料水比保持1：1.2，45℃下酶解24 h，测定小肽的含量。

1.2.2.2 酶解时间对小肽含量的影响

称取50 g菜粕，在酶添加量为100 U/g，料水比为1： 1.2，45 ℃下酶解 12、24、36、48、60 h，测定小肽的含量。

1.2.2.3 料水比对小肽含量的影响

称取 50 g 菜粕，分别以 1： 0.8、1： 1.0、1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6的料水比，酶添加量为100 U/g，在45℃下酶解24 h，测定小肽的含量。

1.2.2.4 酶解温度对小肽含量的影响

称取50 g菜粕，在酶添加量为100 U/g，料水比为1： 1.4，分别在 35、40、45、50、55 ℃下酶解 24 h，测定小肽的含量。

1.2.3 酶解工艺优化的正交试验

根据单因素试验的结果，菜粕酶解试验的优化采用酶添加量：100、125、150 U/g ；酶解时间：24、36、48 h ；料水比：1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6；酶解温度：45、50、55 ℃的4因素3水平正交试验，共设9个处理，测定小肽含量，分析结果，得出最优工艺条件。

1.2.4 酶活测定方法

参照浙江省地方标准DB33。

1.2.5 小肽含量测定方法

将待测样品过80目筛，等体积加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min摇床中30 min，而后4 000 r/min离心15 min，取上清液做适当稀释后测定蛋白质总量。

1.2.6 蛋白质总量测定

采用凯氏定氮法，参照GB/T GB 6432——94。

1.2.7 硫甙含量测定方法

称取样品100 mg装入10 ml试管中，在沸水浴中干热10 min，加入约90℃热蒸馏水8～10 ml，再置沸水浴中20min以上，冷却后，蒸馏水稀释，混匀，放置20min，用滤纸过滤或者4 000 r/min离心5 min。移取2 ml滤液于10 ml刻度试管中，加4 ml羧甲基纤维素钠，再加入2 ml PbCl2，混匀，放置1 h。在540 nm下比色，以蒸馏水加羧甲基纤维素钠做参比测定吸光度值E1。

再分别取滤液2 ml于另一带塞的10 ml试管中，加入羧甲基纤维素钠4 ml，0.03 mol/l HCl 2 ml，在室温下放置2 h，以蒸馏水加羧甲基纤维素钠做空白测定吸光度值E2。计算公式为E=E1-E2。最终的计算公式为：硫甙含量（μmol/g）=0.2+185.2E。

2 结果及分析

2.1 菜粕酶解条件的研究

2.1.1 酶添加量对酶解菜粕小肽含量的影响（见图1）

利用中性蛋白酶酶解菜粕，可以提高菜粕中小肽的含量，而且随着酶添加量的增加，菜粕中小肽含量也呈增加的趋势。由图1结果可见：当酶添加量为125 U/g时，酶解菜粕小肽的含量最高，为128.27 mg/g，比对照提高了282.44%。

2.1.2 酶解时间对酶解菜粕小肽含量的影响（见图2）

以提取后的蛋白为底物的酶解，所需的时间都较短。但本试验的工艺是直接以菜粕原料为底物，因此选取的酶解时间较长。由图2结果可见：随着酶解时间的延长，小肽的含量呈上升趋势。酶解时间为48 h时，小肽的含量最高，为121.28 mg/g，比对照提高了261.60%。当酶解时间长于48 h，随着酶解时间的延长，小肽被进一步酶解生成游离氨基酸，含量反而出现下降趋势，因此酶解时间不宜过长，选择48 h较为合适。

2.1.3 料水比对酶解菜粕小肽含量的影响（见图3）

常规的酶解试验，一般在料水比较小，即含水量较大的情况下进行。但含水率过高，会增加染杂菌的概率，同时增加后处理的难度和成本。本试验选取的料水比较大，以增强工业生产可行性。由图3结果可见，随着原料含水率的增加，小肽的含量呈现增高的趋势，当料水比为1：1.4时，小肽含量最高，为135.94mg/g，比对照提高了305.31%。物料含水率过大时，酶解菜粕中的小肽含量反而下降，这也与小肽被进一步降解成游离氨基酸有关，因此料水比选择1：1.4较为合适。

2.1.4 酶解温度对酶解菜粕小肽含量的影响

温度是影响酶活性的一个重要因素，而酶活性的高低，直接影响酶解菜粕的小肽含量。由图4结果可见，随着酶解温度的增高，酶的活性越来越高，小肽的含量也随之升高，当酶解温度为50℃时，达到最高，为125.57 mg/g，比对照提高了274.39%。酶解温度高于50℃时，酶的活性下降，相应的酶解菜粕中小肽的含量也明显下降。因此，酶解温度不宜高于50℃。

2.1.5 菜粕酶解工艺优化的正交试验

以单因素试验为基础，酶添加量、酶解时间、料水比、酶解温度为因素，以小肽含量为指标设计4因素3水平正交试验。试验设计见表1，试验结果见表2，试验结果的正交分析见表3。

表1 正交试验设计

表2 正交试验设计和测定结果

由表2试验结果可见，菜粕酶解的最佳条件为D1A2C1B3，即酶添加量为125 U/g，酶解时间为48 h，料水比为1：1.2，酶解温度为45℃时，酶解菜粕中小肽含量有最大值。

表3中正交分析的结果表明，各因素对小肽含量影响的大小次序为D（酶解温度）＞A（酶添加量）＞C（料水比）＞B（酶解时间）。其中，酶解温度对小肽含量的影响最为显著。

表3 正交试验结果方差分析

2.1.6 酶解菜粕的工艺稳定性

依照正交试验得出的最优工艺条件（酶添加量为125 U/g，料水比为 1：1.2，时间为48 h，酶解温度为45℃），进行了5个批次的重复酶解处理试验，检测酶解菜粕工艺的稳定性，结果见表4。

表4 酶解菜粕工艺稳定性试验结果

试验结果表明：菜粕原料经酶解后，小肽含量大幅提高，硫甙的含量也有相应的降低，经多批次重复试验，小肽含量和硫甙含量指标均较稳定。

3 结论

通过单因素和正交试验，确定了中性蛋白酶酶解菜粕的最佳条件：酶添加量为125 U/g，酶解时间为48 h，料水比为1：1.2，酶解温度为45℃，此时，小肽含量有最大值。依照正交试验结果，对菜粕最佳酶解条件进行5次重复试验验证，酶解菜粕的小肽含量在135.10～139.60 mg/g之间，平均值为 137.26 mg/g，与正交试验结果相符，说明酶解工艺是稳定的。中性蛋白酶在提高菜粕中小肽含量的同时，对菜粕中的硫甙也有一定的去除效果，通过酶解，硫甙含量由原菜粕的50.94 μmol/g 降低到平均 26.31 μmol/g，降解率可达到48.34%。

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