临床型奶牛乳腺炎致病菌分析及药敏试验

刘 红，高学军，车有权，刘 云，陆江宁，刘洪杰，鲁兆宁，杨名赫，邬立刚，齐帮若，高月林

（1.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

奶牛乳腺炎是一种多因素性疾病。是乳腺受到物理、化学、微生物刺激所发生的一种炎性变化，乳汁中体细胞含量增加，乳腺组织发生病理变化，是奶牛饲养场的常发病之一，影响世界奶牛业发展，给乳品生产造成巨大的损失。临床型乳腺炎是奶牛乳腺炎的一种表现形式，不仅造成奶产量和奶质的降低，严重者还会导致乳房废弃，乳区化脓、坏疽、萎缩，致使患牛永远失去泌乳能力而被淘汰[1]。在我国，临床型乳腺炎的发病率占奶牛乳腺炎总发病率的21%～23%，因其被淘汰的奶牛约占总淘汰牛的9%～11%[2-3]。导致引起奶牛乳腺炎的因素很多，其中病原微生物是导致乳腺炎的最主要原因。了解奶牛乳腺炎的致病菌的类型、分布及其敏感的药物对于乳腺炎的预防和治疗以及疫苗的研制均有非常重要的指导作用。

佳木斯市奶牛业比较发达，是黑龙江省重要的奶源基地。该市奶牛的疾病主要是乳腺炎，每年奶牛场由于乳腺炎尤其是临床型乳腺炎造成的损失达上亿元。因此掌握临床型乳腺炎的致病菌种类及其敏感的药物，是提高该市奶牛场经济效益的关键。目前国内外对奶牛乳腺炎主要采用抗生素治疗，抗生素中，众多报道显示使用氟喹诺酮类药物治疗乳腺炎的效果优于其他抗生素[4-7]。中国采用传统的中医学治疗奶牛乳腺炎也收到了较好的效果，近年来许多学者研究出中药新型制剂如透皮剂，以促进中药的吸收，提高治疗效果[8-9]。通过调查，掌握佳木斯市治疗临床型奶牛乳腺炎主要使用青霉素类、头孢菌素类以及氨基糖苷类抗生素，未使用过氟喹诺酮类抗菌药。由于乳腺炎疾病的发生和地区环境的联系非常紧密，无法从其他地区的报道来分析本地区的乳腺炎发病情况。因此，本试验主要通过对佳木斯市4所奶牛场的17头患有临床型乳腺炎的奶牛的20份乳样进行致病菌分离鉴定，从病原学上研究佳木斯市临床型奶牛乳腺炎病原的特点，并对分离得到的致病菌进行8种氟喹诺酮类药物的体外药敏试验，筛选出疗效好、副作用小的抗生素类药物，指导该市临床用药，为了探讨中药治疗乳腺炎的优越性，本试验选择了文献报道的治疗临床型乳腺炎效果好的3组中草药复合方剂，通过体外药敏试验选出疗效较好的方剂，从中兽医的角度来治疗乳腺炎，希望通过本试验的研究能为该市的临床型奶牛乳腺炎疾病的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳样来源

本试验检测的乳汁样品来源于佳木斯市4所奶牛场17头患有临床型乳腺炎的奶牛的不同乳区，共计20份。其中1号奶牛场采集乳汁样品7份，2号奶牛场采集乳汁样品9份，3、4号奶牛场各采集乳汁样品2份（1、2号奶牛场为大型饲养场；3、4号奶牛场为散户）。

1.1.2 试剂及培养基

培养基：普通营养琼脂、兔鲜血琼脂培养基，麦康凯琼脂、营养肉汤、血清肉汤、蛋白胨、牛肉浸膏等，配制方法参阅文献[10]。

细菌微量生化反应管：三糖铁斜面、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、乳糖、水杨苷。

试剂：3%过氧化氢，无菌兔血浆，6.5%氯化钠琼脂平板，革兰氏染色液。

1.1.3 药品

抗生素：采用杭州天和微生物试剂有限公司生产的诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星、环丙沙星、氟罗沙星、洛美沙星药敏纸片。

中药：购于佳木斯市金天大药房。

方剂I：当归、川山甲、金银花、连翘等12味中药组成。主药是当归、川山甲。

方剂Ⅱ：牛蒡子、连翘、金银花、紫花地丁等10味中药组成。主药是牛蒡子、连翘。

方剂Ⅲ：蒲公英、金银花、当归、川芎等11味中药组成。主药是蒲公英、金银花。

1.2 方法

1.2.1 乳样的采集方法

首先将患病乳房进行消毒处理，用温水将乳房擦洗干净，0.2%新洁尔灭擦洗乳房，再用75%的酒精溶液消毒乳头，然后带上灭菌手套进行人工榨乳，弃去头两把乳，排除污染的杂菌，第三把乳开始用灭菌中等大小试管接住，大约采集5 mL左右，然后迅速将灭菌试管口在酒精灯上火焰消毒，塞上灭菌试管塞，标明牛号、乳室、日期后放入冰桶，送回实验室进行细菌检验。

1.2.2 乳样的培养方法

用一次性注射器抽取0.5 mL的待检乳汁倾注到培养平皿的一端，然后匀速晃动平皿并慢慢倾斜平皿使乳汁均匀地覆盖在整个平皿上，放入37℃温箱培养。

1.2.3 细菌的分离与鉴定

将20份乳样接种到普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上培养18～24 h后取出，观察长出的菌落形态，根据菌落的形态、大小、颜色等将菌落大致分类，然后配合革兰氏染色特点、显微镜下检查，观察细菌的形态仔细进行分类，排除环境中常存在的无致病性细菌，一般为革兰氏染色呈阳性的粗大杆菌。将挑选出来的细菌作进一步的纯培养，培养方法同上。纯培养后镜检无杂菌者保存于试管斜面培养基内，即可按有关生化鉴定方法进行生化鉴定。

1.2.4 生化鉴定试验

将分离纯化的细菌进行革兰氏染色、溶血试验、各种糖发酵试验、过氧化氢试验、三糖铁试验、血浆凝固酶试验、CAMP试验、6.5%NaCl试验、马尿酸、七叶苷、柠檬酸盐试验、吲哚试验、M.R.试验、V-P试验、硫化氢试验、尿素酶试验、运动力等检查。

1.2.5 抗生素药敏试验

采用药物纸片琼脂扩散法将分离鉴定出的致病菌种，葡萄球菌挑取5个菌落、链球菌挑取20个菌落，接种于2 mL肉汤培养基中，37℃增菌16 h（链球菌需24 h且接种在血清肉汤内），取出后的菌液用生理盐水稀释1 000倍，稀释液取0.8 mL倾于普通琼脂平板表面（链球菌需鲜血琼脂平板），使其均匀平铺于表面弃去多余的菌液，置37℃干燥15 min，贴上制备好的药敏纸片，每个平板最多贴6片，37℃培养18 h后取出，用圆规和直尺测量抑菌圈的直径，记录抑菌圈大小，根据药敏试纸说明书判定敏感性（见表1）。

表1 药敏试验判定标准Table1 Judging standard of drug susceptivity testing

1.2.6 中药药敏试验

1.2.6.1 中药针剂的制作方法

采用水提醇沉淀法提取[11]。

1.2.6.2 中药药敏试验方法

将购买的药敏试验滤纸片装入一个洁净干燥的青霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌30 min，取出后放入温箱，干燥备用。用微量移液器向装有纸片的小瓶中分别加入中药药液0.5 mL，相当于每片含药量为0.0125 g。用无菌镊子轻轻翻动，使滤纸片均匀吸净药液，放入4℃冰箱冷藏3 h取出，将药敏片放入灭菌青霉素小瓶中加盖灭菌橡皮塞，4℃保存备用[12]。采用药物纸片琼脂扩散法进行药敏试验，方法同抗生素药敏试验。

2 结果与分析

2.1 致病菌的分离纯化结果

在20个乳汁样品中共分离得到致病菌508株。通过初步的细菌分离试验结合显微镜下检查发现，分离得到的致病均为葡萄球菌和链球菌。其中葡萄球菌共分离得到234株，链球菌共分离得到274株，分别占致病菌总数的46.06%（234/508）、53.94%（274/508）。其中分离得到的234株葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌有180株，表皮葡萄球菌有54株，分别占致病菌总数的35.43%、10.63%；分离得到的274株链球菌中，无乳链球菌有203株，乳房链球菌有57株，化脓链球菌有14株，分别占致病菌总数的39.96%、11.22%、2.76%（见表 2）。

表2 临床型乳腺炎的主要致病菌种类及其分离率Table2 Important pathogen classification and percentage of clinical mastitis

2.1.1 金黄色葡萄球菌的生化鉴定

金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，在普通琼脂平板上形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，随培养时间和菌株的不同菌落颜色稍有差异，有金黄色和黄白色，其在血液琼脂平板上培养时有溶血现象。其生化特性为：兔血浆凝固酶试验呈阳性、过氧化氢试验呈阳性、在有氧和厌氧条件下均可分解甘露醇、三糖铁培养基底部变黄。

2.1.2 表皮葡萄球菌的生化鉴定

表皮葡萄球菌革兰氏阳性球菌，在普通琼脂平板上形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落，边缘整齐或略有不齐，菌落颜色有白色、奶白色、淡黄色，其生化特性为：兔血浆凝固酶试验阴性、过氧化氢试验阴性或弱阳性，三糖铁培养基底部变黄，在厌氧条件下不分解甘露醇，但在有氧条件下有些菌株可以分解。

2.1.3 无乳链球菌的生化鉴定

无乳链球菌是革兰氏阳性球菌，在血清肉汤中常呈长链排列，在固体培养基生长或病料涂片常呈现短链状或成对出现。在普通琼脂培养基上生长不良或不生长，在血液琼脂培养基上生长形成半透明的灰色、隆起、闪光的小菌落，在血平板上，菌落周围能产生狭窄而清晰的β型或α型溶血带，其生化特性为CAMP试验阳性，这是无乳链球菌区别于其他链球菌的最主要的特性，另外在高盐琼脂中不生长、可分解乳糖、不分解甘露醇和山梨醇。

2.1.4 乳房链球菌的生化鉴定

乳房链球菌革兰氏染色为阳性，呈短链状，在普通琼脂培养基上生长不良或不生长，在血液琼脂培养基上生长形成半透明的灰色、隆起、闪光的小菌落，不产生溶血情况，其生化特性为CAMP试验阴性、在高盐琼脂中不生长、分解乳糖，分解甘露醇和山梨醇。

2.1.5 化脓链球菌的生化鉴定

链球菌革兰氏染色为阳性，呈成对或短链状，在普通琼脂培养基上即可生长，在血液琼脂培养基上生长更好，形成半透明的灰色、隆起、闪光的菌落，产生β型溶血情况，其生化特性为CAMP试验阴性、在高盐琼脂中不生长、不分解乳糖，不分解甘露醇和山梨醇。

2.2 药敏试验结果

2.2.1 抗生素药敏试验结果

选择的8种氟喹诺酮类抗菌药对临床分离得到的致病菌的抑菌效果均较好。其中，加替沙星对表皮葡萄球菌、无乳链球菌、化脓链球菌的抑菌效果最好，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不如恩诺沙星，但统计学分析差异不显著（P>0.05）。因此，加替沙星对分离的临床型奶牛乳腺炎的致病菌的抑菌效果最好（见表3）。

表3 抗生药药敏试验结果Table3 Results of antibiotic susceptivity testing （mm）

2.2.2 中药药敏试验结果

选择的3组中药方剂中，方剂I对乳房链球菌的抑制效果最好，其次为无乳链球菌、金黄色葡萄球菌，对化脓链球菌的抑制作用较弱，对表皮葡萄球菌无抑制作用；方剂Ⅱ对分离得到的致病菌无抑菌作用；方剂Ⅲ的抑菌效果弱于方剂Ⅰ，强于方剂Ⅱ，对表皮葡萄球菌和化脓链球菌无抑菌效果，对其他3种致病菌的抑制效果同方剂Ⅰ（见表4）。

表4 中药药敏试验结果Table4 Results of Chinese traditional medicine susceptivity testing （mm）

3 讨论与结论

3.1 细菌学分析

本试验从20份乳样中，共分离508株细菌，包括葡萄球菌和链球菌两大类。与报道的奶牛乳腺炎的主要致病菌为葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌不一致[13-14]。可能是不同地区有不同的致病菌，也可能与采集乳汁样品的时间有关系，本试验采集乳汁样品是在12月份，天气比较寒冷，不利于肠杆菌属的生长，且泌乳奶牛即将进入干奶期，由于铁结合蛋白-乳铁蛋白的抗菌活性作用可能抑制了大肠杆菌的生长[15]。本试验检出的致病菌中葡萄球菌和链球菌分别占检出数的46.06%和53.94%，所占致病菌检出数的比率相当。这与陈坤永等[16]、许丹宁[12]报道的引起临床型乳腺炎的致病菌主要为链球菌不一致。分离得到的临床型乳腺炎的主要致病菌中金黄色葡萄球菌检出率为35.43%、无乳链球菌的检出率为39.94%，二者占临床乳腺炎致病菌检出数的75.37%。说明佳木斯市奶牛临床型乳腺炎的主要致病菌为金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。这与黄瑛等报道的引起奶牛乳腺炎的主要致病菌为无乳链球菌[17]，部分为大肠杆菌不同。在被检的20个乳区中，单独感染葡萄球菌的乳区有3个，感染链球菌的乳区2个，其余均为葡萄球菌和链球菌混合感染，混感现象严重。

3.2 药敏试验分析

药敏试验表明，分离得到的致病菌对8种氟喹诺酮类药物均敏感，其中对加替沙星的敏感度最高，可见，氟喹诺酮类药物，尤为加替沙星可用于治疗佳木斯市临床型奶牛乳腺炎。3组中药方剂中方剂Ⅰ的抑菌效果最好，但由于国内对于用中药进行药敏纸片法测定抑菌效果还没有一定的规范的标准，目前还只能根据有无抑菌圈进行判定，抑菌圈越大说明效果就越好[7]，所以本试验分离得到的致病菌对选用的3组中药方剂的敏感度无法判定。由于本试验中，3组中药方剂的抑菌圈均较小甚至无抑菌圈，所以该3组方剂不是治疗佳木斯市奶牛临床乳腺炎的最理想的中药制剂，因此，该市临床型奶牛乳腺炎的中药制剂德治疗还需要进一步研究。

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