肉味香基中的抗氧化物质的分离及抗氧化活性

汪何雅，于汐洋，钱 和*，姚卫蓉

肉味香基中的抗氧化物质的分离及抗氧化活性

汪何雅，于汐洋，钱 和*，姚卫蓉

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

目的：对肉味香基中具有抗氧化活性的成分进行分离，探讨其结构和功能之间的关系。方法：利用膜分离和色谱分离手段对肉味香基中抗氧化成分进行分离，考察各组分对AAPH和Fe3+/VC诱导的卵磷脂脂质体氧化以及脂质体自动氧化的抑制效果。结果：根据分子质量将肉味香基分离得到3个分子质量段的美拉德反应产物(MRPs)，其中高分子质量MRPs(H-MRPs)抗氧化活性最强；H-MRPs进一步分离得到H-MA、H-MB、H-MC 3类组分，极性由弱到强为：H-MA＜H-MB＜H-MC，抗氧化能力从高到低为：H-MA＞H-MB＞H-MC。结论：肉味香基中主要发挥抗氧化作用的组分是高分子质量MRPs，并且其极性越弱，抗氧化能力越强。

肉味香基；抗氧化；美拉德反应产物(MRPs)；卵磷脂脂质体(LPS)

通过氨基酸或植物蛋白水解物与还原糖高温加热发生美拉德反应(Maillard reaction)，制备得到的反应型肉味香基，其香味逼真，成本低廉，是开发咸味香精必不可少的配料，主要用于方便面调料、鸡精、罐头、熏肉、酱肉、香肠、火腿肠、香辣酱等食品以及动物饲料和宠物食品[1]，以增加或赋予食品肉风味，满足人们对肉风味的需要。美拉德反应是在食品加工和储存过程中氨基酸或蛋白质和碳水化合物发生的一系列复杂反应，它是食品烹调和加工过程中产生食品风味和食品色泽的重要途径。许多研究表明氨基酸-还原糖、面包皮/咖啡提取物或热处理的膳食中的美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)具有抗氧化功能[2-5]。MRPs的抗氧化功能主要来源于有色物类黑精、还原酮及一系列含N、S的杂环化合物，其中的某些物质的抗氧化能力能达到常用抗氧化剂同样的水平，如在高脂类食品中加入MRPs产物能抑制脂类氧化[6]。近年来，针对氨基酸-还原糖高温反应产物、面包皮提取物、咖啡提取物以及高温加热膳食中存在的MRPs的抗氧化性已有大量研究，但对于咸味香精中MRPs的抗氧化功能还未见报道。本研究以咸味香精调配前的肉味香基为对象，利用膜过滤和色谱分离手段对肉味香基中抗氧化成分进行分离，探讨肉味香基中抗氧化成分的结构和活性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉味香基 国内某香精公司；MWCO 8000～14000透析袋、GF254薄层硅胶板、硅胶(100～200目) 国药集团化学试剂有限公司；MWCO 1000超滤膜片 无锡赛普膜科技有限公司。

大豆卵磷脂(纯度98%)、2,2 -盐酸脒基丙烷(AAPH，纯度98%) Sigma公司；硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗坏血酸(VC)均为化学纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UF201超滤设备 无锡赛普膜科技有限公司；R-501旋转蒸发器 上海申顺生物科技有限公司；YD-900L超声波细胞粉碎机 上海之信仪器有限公司；THZ-82恒温水浴振荡器 常州国华电器有限公司；WFJ7200可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 肉味香基中抗氧化成分的初步分离

称取肉味香基，稀释、抽滤得澄清液体。4℃去离子水透析，直到透出液呈无色透明，未透出液记为H-MRPs(＞14kD)，冷冻干燥备用。浓缩透出液，利用截留分子质量1kD的超滤膜进行超滤分离(使用压力0.5MPa)，收集滞留液及滤液，分别记为M-MRPs(1～14kD)、L-MRPs(＜1kD)，冷冻干燥备用。

1.4 硅胶柱层析分离纯化H-MRPs

称量100～200目硅胶100g，加入一定量的95%乙醇充分搅拌成匀浆。将硅胶边搅拌边缓缓倒入层析柱(25mm×200mm)中，待硅胶沉积后，再加入95%乙醇使床层压实。称取一定量的H-MRPs，配成质量浓度为10mg/mL的溶液，湿法上样2～3mL。用洗脱剂进行洗脱，洗脱速度为0.5mL/min，每5min收集一管洗脱液，用紫外-可见分光光度计于420nm波长处检测MRPs含量，收集洗脱液进行冷冻干燥

1.5 各组分对卵磷脂脂质体氧化水平的影响

1.5.1 大豆卵磷脂脂质体(LPS)的制备

参照文献[7]并稍加改进。大豆卵磷脂溶解于石油醚中，通过旋转蒸发器(3500r/min，水浴35℃)和氮气去除有机溶剂，得到均匀分散的卵磷脂薄膜，加入10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，超声波处理15min，得到白色、乳状的脂质体溶液LPS，LPS终质量浓度为10mg/mL。

1.5.2 各组分对卵磷脂脂质体氧化水平的影响

1.5.2.1 AAPH诱导氧化

在试管中加入LPS和不同质量浓度的样品，其中LPS终质量浓度10mg/mL，然后加AAPH(终质量浓度10mg/mL)。加样完毕后避光于37℃水浴孵育1h，冷却，用TBA法[8]测定脂质过氧化程度。测定步骤如下：

反应体系中加入2mL TCA-TBA-HCl(1.68g TCA和41.6mg TBA溶解于10mL 0.125mol/L HCl溶液中)，混合液于沸水浴加热15min，迅速冷却，5500r/min离心20min，取上清液于532nm波长处测定得到吸光度As，以重蒸水代替样品做为空白对照，测得吸光度 Ac。按下式计算样品对脂质体过氧化的抑制率。

1.5.2.2 Fe3+/VC诱导氧化[9]

试管中依次加入1mL LPS、1mL 400μmol/L FeCl3、1mL 400μmol/L VC和1mL样品，混匀。避光并于37℃水浴加热60min，冷却。脂质过氧化程度的测定方法同1.5.2.1节。

1.5.2.3 自动氧化

试管中加入LPS，避光并于37℃水浴加热24h，冷却。脂质过氧化程度的测定方法同1.5.2.1节。

2 结果与分析

2.1 不同分子质量MRPs的抗氧化活性

表1 肉味香基以及不同分子质量的MRPs对3种脂质过氧化体系的抑制率Table 1 Inhibitory effects of the meat flavor studied and its ultrafiltration fractions on the induced oxidation and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes %

本研究所选择的肉味香基是通过植物蛋白水解物与还原糖高温加热制备得到的，是直接的美拉德反应产物。由表1可见，在3种脂质体氧化模型中，肉味香基都具有一定的抗氧化性；分离得到的3种分子质量范围的MRPs中，高分子质量的美拉德反应产物(H-MRPs)发挥较高的抗氧化活性。早在1953年，Hodge等[10]首先报道了有关美拉德反应产物具有防止植物油氧化的效果。Franzke等[11]在1954年也发现，人造奶油中添加甘氨酸-葡萄糖反应产物后可以提高人造奶油的氧化稳定性。目前许多研究表明氨基酸-还原糖模拟体系的反应产物、面包皮/咖啡提取物或热处理的膳食中的美拉德反应产物具有抗氧化功能[2-5]。另有研究发现MRPs还具有很强的消除活性氧的能力[12]。近年来大量研究结果显示，MRPs中起主要抗氧化、消除活性氧等作用的物质是一类高分子质量的食品类黑精[13-15]，Yoshimura等[16]初步研究葡萄糖-甘氨酸的反应产物的抗氧化能力时发现，一部分类黑精抗氧化能力甚至超过BHA和没食子酸丙醋等。这些研究结果与本实验结果相似。

2.2 硅胶柱层析法对H-MRPs进行分离纯化

2.2.1 流动相的确定

结合文献，根据美拉德反应产物的性质，选定以下几组流动相：正己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯、正丁醇-水、乙醇-水，考察它们在TLC板上对H-MRPs的分离情况，结果见图1。

图1 各流动相体系的薄层色谱图Fig.1 Thin layer chromatographic profiles of the high-molecular weight fraction using different mobile phases

由图1可知，只有正丁醇-水和乙醇-水体系能达到较佳的分离效果；而且，后者的Rf值为0.756，分离效果更好。因此，确定95%乙醇-水作为流动相来分离H-MRPs。

2.2.2 乙醇-水作为流动相分离H-MRPs

图2 不同的乙醇-水洗脱配比对产品洗脱特性的影响Fig.2 Effect of different ethanol concentration gradients on further fractionation of the high-molecular weight fraction

由图2可知，H-MRPs经硅胶柱分离得到3个组分，按洗脱得到的先后顺序分别为H-MA、H-MB、H-MC。当起始洗脱剂为95%乙醇时，H-MA组分和H-MB组分得到了较好的分离；然后，加大洗脱剂的极性，进一步洗脱出组分H-MC(图2c)。因此，选用95%乙醇-水洗脱体系对H-MRPs进行梯度洗脱，收集得到H-MA、H-MB、H-MC 3种组分，3种组分质量比为3.2:1:2.3。硅胶柱层析是根据极性不同来分离H-MRPs，由于乙醇极性小于水的极性，因此分离得到的3个组分极性由大到小为：H-MC＞H-MB ＞H-MA。2.3各组分对卵磷脂脂质体氧化水平的影响

图3 H-MRPs各组分对AAPH诱导的脂质体过氧化的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on AAPH induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

图4 H-MRPs各组分对Fe3+/VC诱导的脂质体过氧化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on Fe3+/VC induced oxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

图5 各组分对脂质体自动氧化的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of the high-molecular weight fraction and its three subtractions on autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes

由图3～5可见，在3种脂质体氧化模型中，H-MA、H-MB和H-MC组分均具有抗氧化效果，并且它们的抗氧化活性由大到小均为：H-MA＞H-MB＞H-MC。当反应物起始质量浓度为5mg/mL时，H-MA、H-MB和H-MC组分对AAPH诱导的脂质体氧化的抑制率分别为76.07%、72.68%和70.36%；当反应物起始质量浓度增加至10mg/mL时，H-MA、H-MB和H-MC组分的抑制率分别增大至98.95%、89.57%和75.12%。并且，在3种脂质体氧化模型中，H-MA组分的抗氧化效果均显著高于H-MRPs(P＜0.05)。因此，本实验研究结果显示，在H-MRPs中，极性较小的组分具有较强的抗氧化能力。

类黑精广泛分布于人们的日常饮食之中，现在已经有学者尝试从食品(如咖啡、黑啤酒和豆酱)中分离和纯化类黑精，然而由于食品中类黑精组成的复杂性以及大量衍生化合物的生成，即使是最先进的分离手段和检测手段也不能完全确定所有类黑精的特性。本研究显示MRPs的极性越弱，抗氧化能力越强，该结果与秦礼康等[17]的研究结果一致。秦礼康等将陈窖豆豉类黑精按极性分离成不同组分，并对各组分的抗氧化效果进行了研究，结果发现，利用大孔树脂S-8分离类黑精得到的无水乙醇洗脱组分，其抗亚油酸氧化能力最强，超过了类黑精粗提物。

3 结 论

肉味香基具有较强的抗氧化活性，其中主要发挥抗氧化作用的组分是高分子质量的美拉德反应产物(H-MRPs)。根据极性对H-MRPs进行进一步的分离纯化，得到极性由弱到强的3个组分：H-MA、H-MB和H-MC。3个组分均具有明显的抗氧化效果，并且其对卵磷脂脂质体氧化的抑制能力随着其极性的增强而减弱。

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Separation of Antioxidant Components from Meat Flavor and Their Antioxidant Capacities

WANG He-ya， YU Xi-yang， QIAN He*，YAO Wei-rong
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The antioxidant components in a commercial meat flavor prepared by Maillard reaction were separated by ultrafiltration and silica column chromatographic fractionation and their antioxidant capacities were investigated by measuring their inhibitory effects on the oxidation induced by AAPH or Fe3+/VC and autooxidation of soybean phosphatidylcholine liposomes. The meat flavor was fractionized into three fractions with molecular weights separately varying in three ranges. Among them, the high-molecular weight fraction had the strongest antioxidant activity, and it was further separated into three subfractions, H-MA, H-MB and H-MC and their order of polarity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC and their order of antioxidant activity was H-MA ＜ H-MB ＜ H-MC. As a conclusion, the major component in the meat flavor responsible for antioxidant activity is the high-molecular weight fraction and the weaker polarity, the stronger antioxidant activity.

meat flavor；antioxidant；Maillard reaction products (MRPs)；liposome (LPS)

TS202.3

A

1002-6630(2010)19-0059-04

2010-01-14

汪何雅(1980—)，女，讲师，博士，研究方向为营养与食品安全。E-mail：heyawang@163.com *通信作者：钱和(1963—)，女，教授，博士，研究方向为食品质量与安全。E-mail：amtf168@126.com