胡椒碱及其衍生物对 SH-SY5Y细胞的保护作用研究

穆丽华,刘 屏＊,胡 园,廖红波,李佳佳

1中国人民解放军总医院药理研究室,北京 100853;2安徽蚌埠医学院,蚌埠 233003

胡椒碱及其衍生物对 SH-SY5Y细胞的保护作用研究

穆丽华1,刘 屏1＊,胡 园1,廖红波1,李佳佳2

1中国人民解放军总医院药理研究室,北京 100853;2安徽蚌埠医学院,蚌埠 233003

对胡椒碱进行结构改造,合成了 4个胡椒碱衍生物。以高浓度皮质酮 (corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态。对包括胡椒碱在内的 5个化合物进行了 SH-SY5Y细胞保护作用的研究。结果表明:胡椒碱、5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid n-propylamine amide(2)以及 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)对 SH-SY5Y细胞有较好的保护作用。其中化合物2对 SH-SY5Y细胞具有明显和持久的保护作用。

胡椒碱;胡椒碱衍生物;结构修饰;SH-SY5Y

抑郁属于情感障碍性疾病,其发病率逐年增加,对人类的健康和生命已构成威胁,并引起了人们的广泛重视。关于抑郁的发病机理和药物治疗机制,人们提出了中枢神经递质假说,认为脑内单胺类递质功能紊乱与抑郁发病有关。植物药作为具有悠久历史的天然药物来源,在抑郁病的治疗中正发挥着越来越重要的作用。

胡椒碱 (piperine)属于桂皮酞胺类生物碱,在自然界中存在广泛,尤其在胡椒科植物中大量存在[1],胡椒碱的药理作用较为广泛,目前已发现具有有抗氧化[2]、免疫调节[3]、抗肿瘤[4]、促进药物代谢[5]等作用。近几年胡椒碱的抗抑郁作用逐渐被发现和报道,李崧等研究发现胡椒碱能够升高脑内5羟色胺水平,具有较好的抗抑郁作用[6]。L ee SA等报道胡椒碱可以抑制MAO活性,从而表现出强的抗抑郁样作用[7]。为了进一步开发利用胡椒碱,我们以胡椒碱为先导化合物对其哌啶环进行结构修饰合成了 4个衍生物。以高浓度皮质酮 (corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态,对包括胡椒碱在内的 5个化合物进行了 SH-SY5Y细胞保护作用的研究。

1 试验部分

1.1 仪器与材料

MultiskanMK3酶标仪 (美国);生物倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司 XDS-1B);CO2气瓶 (北京华宇辰气体有限公司);CO2减压器 (上海三友仪器厂);pH计 (葡萄牙 HANNA pH211)噻唑蓝[methyl thiazolyl tetrazolium,MTT](Merck产品); DMEM培养基(Gibco公司);马血清和胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司);皮质酮 (美国 Sigma公司);地昔帕明(美国 Sigma公司);SH-SY5Y细胞株由军事医学科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 胡椒碱衍生物制备

以胡椒碱为起始原料,胡椒碱在碱性条件下水解为胡椒酸,胡椒酸与氯化亚砜发生酰氯化反应,再与胺类化合物反应得到相应的 3个胡椒酰胺类产物(2～4),另外,胡椒酸在酸性条件下与甲醇发生酯化反应,生成胡椒酸甲酯。这两个反应收率较高,操作简单,是实验室常用的反应。

图 1 胡椒碱衍生物的合成路线Fig.1 Synthesis of derivatives of piperine

1.2.2 细胞培养和检测

将 SH-SY5Y细胞培养于含体积分数为 10%马血清的 DMEM培养液中,置于 37℃、体积分数为5%的 CO2培养箱中传代培养,每隔 2～3 d换培养液 1次。

阳性药地昔帕明的配制:精密称取地昔帕明0.30 mg,用空白DMEM稀释至 20 mL,得浓度为 50 μmol/L,用无菌滤头过滤除菌,保存于 4℃冰箱避光备用。给药时,地昔帕明加入 96孔板中每孔 10 μL,每孔终体积为 100μL,则地昔帕明终浓度为 5 μmol/L。

取对数生长期细胞,消化后充分吹打成单细胞悬液,计数后稀释成 1×105Cell/mL,接种到 96孔培养板中(每孔100μL),分别加入浓度为2、20、200 μmol/L的药液,每个浓度设 5个复孔,每孔 10μL,之后加入 4000μmol/L皮质酮 10μL每孔。空白孔加入20μL DMEM,对照孔中加入 10μL DMEM后加入 10μL浓度为 4000μmol/L的皮质酮,阳性药孔加入10μL浓度为50μmol/L地昔帕明后加入10 μL浓度为 4000μmol/L的皮质酮然后放入培养箱。培养 24和 48 h后,弃去培养液,每孔加入新鲜配置的含 5 mg/mL MTT的无血清培养基,37℃下继续培养 4 h后,离心,除去上清液,每孔加入DMSO 150 μL待蓝色颗粒完全溶解,置微量振荡器上振荡 5 min使其充分溶解。在酶标仪上测定 570 nm波长处的吸光度 (A570nm)值,用于定量反映活细胞数。

1.2.3 统计处理

2 结果

2.1 胡椒碱及其衍生物对皮质酮造成的 SH-SY5Y细胞损伤的影响

与模型组相比较,在皮质酮损伤 24 h后,化合物 2高剂量组对 SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。皮质酮损伤 48 h后,胡椒碱高剂量组,化合物 2高剂量组和化合物 4中剂量组对 SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。本实验结果表明胡椒碱的衍生物化合物 2对 SH-SY5Y细胞具有明显和持久的保护作用。结果见表 1。

表 1 胡椒碱及其衍生物对皮质酮损伤的 SH-SY5Y细胞的影响 (±s,n=5)Table 1 Effects of Piperine and its derivatives on corticosterone-injured SH-SY5Y cell(±s,n=5)

表 1 胡椒碱及其衍生物对皮质酮损伤的 SH-SY5Y细胞的影响 (±s,n=5)Table 1 Effects of Piperine and its derivatives on corticosterone-injured SH-SY5Y cell(±s,n=5)

组别 Group 剂量 (μmol/L)A570nm(24 h)A570nm(48 h)空白 – 2.43±0.30 2.28±0.35对照(皮质酮) 400 1.34±0.22b1.62±0.24b地昔帕明 5 1.63±0.14a1.91±0.11a2 1.40±0.13 1.78±0.21皮质酮 +胡椒碱 20 1.57±0.09 1.73±0.11 200 1.31±0.13 1.93±0.08a2 1.45±0.10 1.56±0.13皮质酮 +化合物 1 20 1.22±0.25 1.47±0.13 200 1.17±0.18 1.37±0.19 2 1.29±0.19 1.57±0.13皮质酮 +化合物 2 20 1.26±0.09 1.46±0.34 200 1.66±0.21a1.94±0.17a2 1.35±0.21 1.34±0.13皮质酮 +化合物 3 20 1.46±0.13 1.48±0.26 200 1.50±0.17 1.46±0.20

注:与对照 (皮质酮)组比较,aP＜0.05,与空白组比较,bP＜0.01。Compaired with model group,aP＜0.05,Compaired with normal control group,bP＜0.01.

3 结果与讨论

临床研究表明,焦虑和抑郁症患者的下丘脑-垂体-肾上腺 (HPA)轴功能亢进,血中糖皮质激素(glucocorticoids,GC)水平显著升高[8]。人的脑神经细胞上存在介导 GC作用的受体,其中海马表达水平最高[9]。HPA轴功能亢进时海马 GC受体由于血中 GC水平持续升高而下调,从而使海马对 HPA轴的负反馈障碍,血中高 GC水平得以维持[10]。抑郁等精神疾患的发生可能与过量 GC对海马的选择性损伤有关[11]。

SH-SY5Y细胞系是人神经母细胞瘤细胞,是一种分化程度较低的肿瘤细胞,该细胞繁殖快,细胞形态,生理和生化功能与正常神经细胞相似,胞体也呈锥体状,同时具有明显的轴突。本文根据文献方法[12]以高浓度皮质酮 (corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态,我们观察了包括胡椒碱在内的 5个化合物在此模型上对 SH-SY5Y细胞的保护作用。实验结果表明,胡椒碱高剂量组,5-(3, 4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid npropylamine amide(2)高剂量组和 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)中剂量组对皮质酮损伤的 SHSY5Y细胞均有一定的保护作用。

以中药的活性成分为先导化合物,进行结构修饰改造、研发新药是国内外药物化学家研究的热点。本试验合成了 4个胡椒碱衍生物,其中化合物 2对SH-SY5Y细胞保护效果好、作用时间长,其抗抑郁作用优于胡椒碱及其他衍生物。胡椒酸与氯化亚砜发生酰氯化反应,再与不同的胺类化合物反应将会得到一系列胡椒碱的衍生物,以利于构建活性筛选的化合物库,本研究作为一种初步探索,为我国从中药活性分子经结构修饰研发新药提供一点参考。

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3 Dogra RK,Khanna S,Shanker R. Immunotoxicological effects of piperine in mice.Toxicology,2004,196:229-236.

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Protective Effect of Piperine and ItsDerivatives on SH-SY5Y Cells

MU Li-hua1,L IU Ping1＊,HU Yuan1,L IAO Hong-bo1,L IJia-jia2

1Departm ent of clinical Phar m acology,Genaral Hosital of PLA,Beijing 100853,China;2Depar tm ent of Phar m acy,Bengbu M edical College,Bengbu 233030,China

The piperinewasmodified and four derivativeswas synthesised.SH-SY5Y cellwas lesion byHigh concertation cort to stimulate the neuro cell in depression or anxiety.Five compounds were screened for protective activity on SHSY5Y.Piperine,5-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2E,4E-pentadienoic acid n-propylamine amide(2)and 5-(3,4-methylenedioxy phenyl)-2E,4E-pentadienoic acid N-methyl piperazine amide(4)showed protective activities on SH-SY5Y cells.Compound 2 showed notable protective effect on SH-SY5Y cells from the lesion done by cort.

piperine;derivatives of piperine;structuralmodification;SH-SY5Y

Q946.91;R285

A

1001-6880(2010)03-0408-03

2009-05-04 接受日期:2009-08-05

国家自然科学基金(30600801)

＊通讯作者 Tel:86-10-66936678;E-mail:liuping126@126.com