富集文库-菌落原位杂交法筛选仿刺参微卫星标记

卢 超,包振民,彭 薇,鄢婧婧,吕雅萌,胡景杰

(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,海洋生命学院,山东青岛266003)

富集文库-菌落原位杂交法筛选仿刺参微卫星标记

卢 超,包振民,彭 薇,鄢婧婧,吕雅萌,胡景杰＊＊

(中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室,海洋生命学院,山东青岛266003)

应用微卫星富集文库—菌落原位杂交的方法,筛选得到了33个仿刺参的微卫星标记。富集文库中900个重组克隆经过菌落原位杂交后,415个(46.1%)为阳性克隆。随机挑取100个阳性克隆进行测序,结果显示这些克隆都含有微卫星位点。设计了57对特异性PCR引物,33对能扩增出清晰的条带。利用48个野生仿刺参个体对33个微卫星位点进行评价,结果显示位点都具有多态性。33个多态位点共获得222个等位基因,平均每个位点获得6.7个等位基因。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的范围分别为0.050 0～1.000 0和0.203 2～0.915 9。结果表明,富集文库—菌落原位杂交法筛选微卫星标记比较高效,获得的微卫星标记可以用于仿刺参的分子遗传学研究。

仿刺参;富集文库;菌落原位杂交;微卫星标记;多态性

仿刺参(A postichopus japonicus)又名刺参,是食用海参中最为名贵的一种,主要分布于我国北方、日本、朝鲜半岛及俄罗斯的远东地区[1]。近些年来,刺参的市场消费量逐年增加,刺参养殖业也得到迅猛发展, 2008年我国的刺参总产量达到9万t,经济总产值超过200亿元,刺参养殖业已经成为我国海水养殖的支柱产业之一。良好的苗种是刺参养殖业健康发展的保障,而传统的育种方法有其局限性。分子标记辅助育种(Marker-assisted selection,MAS)在筛选和鉴定优良性状个体、加快育种进程等方面起着重要的作用。

微卫星标记(Microsatellites),又称短串联重复序列(Simple tandem repeats,STRS)或简单重复序列(Simple sequence repeats,SSRS),由1～6个核苷酸为重复单位的串联重复片段构成[2]。微卫星分子标记具有较高的多态性,呈共显性遗传,并且具有较高的稳定性和可重复性2,正是由于以上优点,微卫星被广泛地应用于构建遗传图谱[3-7]、QTL(Quantitative trait locus)定位[8-9]及遗传学分析[10-11]等。

关于仿刺参的研究长期以来主要集中于人工育苗和增养殖技术方面,遗传学方面的研究开展较晚,Zhan等[12]开发了45个仿刺参的多态性微卫星标记;Peng等[13]从EST数据库中筛查了38个仿刺参多态性微卫星标记;谭杰等[14]用9对微卫星引物对3个不同仿刺参地理种群的遗传结构进行了研究;Li等[15]构建的仿刺参遗传连锁图谱中包含了21个微卫星标记。微卫星标记偏少成为仿刺参分子遗传学研究的限制条件,因此有必要继续微卫星标记的开发。本文采用富集文库-菌落原位杂交法筛选了33个刺参的微卫星标记,并对一些主要的参数进行了估算。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2008年5月在山东荣成附近海域采集了48只仿刺参样品,取其肌肉组织用95%乙醇固定后置于-20℃冰箱保存。

1.2 DNA的提取

参照战爱斌等[16]的方法。提取DNA后用紫外分光光度计定量,-20℃保存备用。

1.3 仿刺参微卫星富集文库的构建

富集文库的构建主要参照战爱斌等[17]的方法,并在DNA的酶切等方面做了适当的调整。

1.3.1 基因组DNA的酶切和接头的连接 限制性内切酶选用RsaI,基因组DNA的量为10μg,酶切产物的回收采用低熔点琼脂糖,片段大小为400～1 200 bp。连接反应条件为16℃下连接12 h。

1.3.2 杂交及洗膜 探针选用(GA)15和(CA)15并标记好,固定在Hybond N+膜上。预杂交2 d后在1%的SDS中洗去未结合牢固的探针。将经过95℃变性的连接产物、预杂交好的Hybond N+膜放入杂交液中在37℃条件下杂交24 h。在经过优化的条件下将含有重复序列的DNA片段从膜上洗脱下来,再经过低温离心沉淀DNA片段,溶于灭菌的三蒸水中,-20℃保存备用。

1.3.3 TA-克隆 将洗脱的DNA片段进行PCR扩增,反应体系为20μL,PCR反应程序为:95℃变性5 min;然后95℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,25个循环; 72℃延伸1 h。将PCR产物连接上载体转化入大肠杆菌DH5α菌株中,用固体培养基培养,构建微卫星富集文库。

1.4 菌落原位杂交

1.4.1 菌落转膜 挑取生长良好的单菌落,转移到新的培养基上培养5～6 h,然后用硝酸纤维素膜(Immobilon-NC Transfer Membranes,Millipore)影印菌落。硝酸纤维素膜经过变性液和中和液处理后,在80℃条件下烘烤2 h,放置备用。

1.4.2 阳性克隆的筛选 先将硝酸纤维素膜放入杂交液中预杂交1 h。然后更换杂交液并加入标记好的探针(GA)15和(CA)15杂交过夜,洗脱去未结合牢固的探针。处理过的硝酸纤维素膜压上X胶片在暗室中显影,在平板对应的位置挑取阳性克隆进行测序。

1.5 测序结果的处理

序列测定后,人工处理去除载体序列,然后进行序列的拼接和独立克隆的识别,所用程序是Vector NTI Suite 8.0(Invitrogen)软件中的Contig Express程序,将独立序列和NCBI数据库中已公布的序列比对,去除冗余序列。

1.6 引物的设计和条件优化

引物设计采用的软件是Primer Premier 5.0,进行引物设计的位点的核心重复两侧序列应当是完整的,引物合成后,用梯度PCR确定最佳退火温度。

1.7 微卫星位点主要遗传学参数的估算

多态性的评价采用48个仿刺参个体,经过PCR扩增后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。需要计算的参数包括每个微卫星位点的观测杂合度(Observed heterozygosity,Ho)和期望杂合度(Expected heterozygosity,He)。具体计算方法如下:Ho为杂合子观察数与样本含量之比;He=1-∑Pi2,式中Pi为该位点中第i个等位基因的频率。采用软件GENEPOP和马尔可夫链法对微卫星位点是否符合哈迪-温博格平衡性(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)进行检测。

2 结果

在文库中随机选900个重组克隆重新均匀地排布于培养基上进行筛选。结果得到阳性克隆415个,阳性克隆率为46.1%。随机挑选100个阳性克隆测序,结果显示所有克隆均含有微卫星DNA。经过软件分析得到79个独立序列,其中有57个(72.2%)位点可以设计PCR引物。通过PCR条件优化,发现33对引物能够扩增出预期大小范围内的片段。对微卫星位点进行多态性评价,扩增结果显示33个位点都具有多态性。33个微卫星位点共获得了222个等位基因,平均每个多态性位点扩增得到6.7个等位基因。部分位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图1,具体每个位点的参数见表1。位点1S27位点获得的等位基因数目最多,为12个;位点HC612仅获得了2个等位基因(见表1)。位点序列重复次数都较高,重复次数在10次以上的位点有27个。33个位点的观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的平均值分别为0.641 0(0.050 0～1.000 0)和0.719 8(0.203 2～0.915 9)。

图1 位点1S07(上)和HC511(下)在20个仿刺参个体中的扩增结果Fig.1 Loci 1S07 and HC511 amplified in 20A.japonicusindividuals

3 讨论

筛选微卫星标记的方法有多种并各有优缺点,战爱斌[18]报道构建富集文库筛选微卫星标记相对高效。构建微卫星富集文库的方法主要有膜富集法和磁珠富集法,其中膜富集法的优点是:整个实验流程操作相对简单,成本较低,更加利于实验的开展。但是此方法也有不足之处,就是洗脱的严谨度比较难以控制,针对不同的物种,洗脱严谨度必须经过优化[19]。磁珠富集法也是一种效率较高的筛选方法,但是操作步骤较繁琐,实验成本相对高。本研究在用膜富集方法构建仿刺参富集文库的过程中,通过洗脱严谨度的良好控制,取得了较好的结果。

表1 33个仿刺参微卫星标记的基本特征及遗传学参数Table 1 Characterization of 33 novel microsatellite markers forA.japonicus

本研究构建刺参微卫星富集文库时采用的寡核苷酸探针为(AG)和(AC)重复序列,这是因为在大多数生物的基因组中,两碱基微卫星重复最为丰富[20-24]。从测序的结果来看(见表1),(AG/CT)重复的位点有6个,(AC/GT)重复的位点有26个,后者明显多于前者,这一现象与大多数动物中微卫星的重复类型相符合[24]。

微卫星DNA长度的变化是微卫星多态性的基础。核心序列的重复次数在同一基因座位的不同等位基因间差别很大,可以产生丰富的多态性。Weber[25]认为,两碱基重复序列只有在重复次数多于12次时,微卫星标记才有可能表现出较高的多态性。Smulders[26]认为重复次数多的微卫星DNA在种内和种间都可以产生多态性,但重复次数少的微卫星在种间就很难产生多态性。本研究获得的这些微卫星序列中,重复次数高于10次的序列共有27个(81.8%),有利于获得多态性高的分子标记。

本研究获得的33个仿刺参多态性位点中有18个位点的观测杂合度和期望杂合度有显著的差异(见表1);Hardy-Weinberg平衡检验发现,这是杂合子的严重缺乏(P<0.005)造成的。有报道分析指出:杂合子缺乏大多是由无效等位基因(Null allele)引起的[3,19]。而产生无效等位基因的原因可能是引物结合部位的序列发生了点突变、插入或缺失[27-29]。在很多物种的微卫星研究中都发现存在无效等位基因的现象,例如,在人类[30]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[31]、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)[3]和斑节对虾(Penaeus monodon)[32]的微卫星位点中都含有无效等位基因。

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Abstract: We isolated and characterized 33 novel microsatellite markers of sea cucumber(A postichopus japonicus)using the method of enrichment-colony hybridization.A total of 900 clones derived from the SSR-enriched library were screened and 415 clones gave the positive response(46.1%).One hundred positive clones were randomly selected for sequencing and the results showed that all of the clones contained microsatellites.Fifty-seven primer pairs were designed using the software Primer Premier 5.0,of which 33 pairs can be amplified scorable PCR products.The polymorphisms of these loci were assessed using 48 individuals sampled from the natural habitat.The results showed that all 33 loci showed polymorphism. A total of 222 alleles were identified with an average of 6.7 alleles over all loci.The values of observed and expected heterozygosities ranged from 0.050 0 to 1.000 0 and from 0.203 2 to 0.915 9,respectively. The results indicated that the method of SSR-enriched library hybridization was of high efficiency,sensitiveness,stability and low cost for isolation of a large amount of microsatellite markers in the target species.These microsatellite markers can be used in a wide range of genetic studies and breeding programs.

Key words: A postichopus japonicus;SSR-enrichmed library;colony hybridization;microsatellite;polymorphic

责任编辑 于 卫

Isolation and Characterization of Microsatellite Markers for Sea Cucumber (Apostichopus japonicus)by Screening the SSR-Enriched Library

LU Chao,BAO Zhen-Min,PENG Wei,YAN Jing-Jing,LV Ya-Meng,HU Jing-Jie
(Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S917

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-137-05

国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A411);十一五国家科技支撑计划(2006BAD09A09);十一五国家科技支撑计划(2006BAD09A10)资助

2010-05-07;

2010-05-25

卢 超(1984-),男,硕士生。

hujingjie@ouc.edu.cn