体外培养间充质干细胞移植对颈动脉损伤后局部NO含量和eNOS mRNA表达的影响1)

赵然尊,石 蓓,郭 艳,许官学,王冬梅,沈长银

再狭窄是临床冠心病介入治疗后较严重的远期并发症。基础研究发现,再狭窄的病理机制包括早期内皮细胞损伤、血管弹性回缩和平滑肌细胞的迁移与增殖、新生内膜增生及晚期血管重塑。现阶段药物洗脱支架治疗可明显抑制平滑肌细胞增殖和新生内膜的增生,降低了再狭窄发生率;然而,支架植入术可引起不同程度的血管壁损伤,并因此加重局部炎症反应而导致更严重的内皮功能障碍和新生内膜增生等病理损伤修复反应。近年研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有促进损伤动脉内皮修复和抑制新生内膜增生的作用[1]。但正常个体外周血循环中MSCs含量极少,动脉损伤后其上述作用效应较弱,不足以阻断再狭窄的发生。本研究在建立兔颈动脉粥样硬化狭窄基础上行球囊损伤,经静脉移植自体间充质干细胞,观察其对粥样硬化颈动脉球囊损伤后再内皮化和内膜增生的影响。

1 材料与方法

1.1 颈动脉粥样硬化模型制备 选用健康纯种大白兔为研究对象,体重2.0 kg±0.5 kg,雌雄不限(均购自第三军医大学动物中心)。大白兔采用经高脂饮食喂养2个月后,制作颈动脉粥样硬化模型,具体制作步骤:以25%乌拉坦1 g/kg耳缘静脉麻醉。无菌条件下,于兔颈前正中皮肤切开3 cm～4 cm的纵切口,充分分离显露右颈外动脉,将右颈外动脉固定于自制的有机玻璃血管槽中,动脉两端以橡皮筋拉紧阻断血流。10 mL注射器内装生理盐水,接4.5号头皮针,平行于血管纵轴方向穿刺阻断血管的一端进入血管内,充盈血管。另一端用4.5号头皮针穿刺进入血管,生理盐水冲洗置换处血管腔内的血液后,空气置换出血管内生理盐水。接上流量150mL/min的医用氮气气流,历时15 min造成内皮干燥,内膜损伤。然后生理盐水置换出血管腔内的气体,放开动脉两端橡皮筋恢复血流,压迫穿刺点4 min～5 min止血,缝合皮下组织和皮肤并包扎。总计完成48只动物模型,随机分为两组,MSCs移植组(n=30)即于球囊损伤后即刻、1周和2周时给予MSCs经耳缘静脉移植;对照组(n=18)于球囊损伤后相同时间点给予等量生理盐水注射。

1.2 MSCs来源与体外培养 MSCs移植组所有动物于球囊损伤前1个月皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF,商品名:赛强,长春金赛药业有限责任公司生产)25 μ g/kg,连续 5 d后,然后采集外周血2次～3次,采用密度梯度离心法并贴壁培养法,分离培养获得MSCs,经流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,一般认为,MSCs均一表达CD44阳性,而 CD34、CD45阴性(USBiological公司,USA),且要求纯度达95%以上。

1.3 MSCs静脉移植 培养的MSCs制成细胞悬液,经鉴定细胞浓度达到108/50 μ L。MSCs移植组于球囊扩张后即刻、1周和2周时经耳缘静脉缓慢注射MSCs悬液每次约2 mL。

1.4 损伤动脉病理形态学测定 两组动物均于术后4周处死,取出球囊损伤的颈动脉约2.0 cm,置于4%多聚甲醛溶液中固定,24 h后常规乙醇梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,然后每份标本横断面非连续取4处切片,切片厚度 5 μ m,经苏木精-伊红(HE)法染色由计算机图像分析仪分析测定下述指标:新近内膜面积(NEA)、中膜面积(M A)、计算内膜/中膜面积比(I/M)。指标界定如下:新近内膜面积即血管腔表面与内弹力膜之间的面积;中膜面积即内弹力膜与外弹力膜之间的面积;内膜/中膜面积比即新近内膜面积/中膜面积。

1.5 损伤动脉细胞增殖程度检测 免疫组织化学染色测定增殖细胞核抗原(PCNA):采用链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物(SABC)法,严格按照试剂盒(购自上海源叶生物科技有限公司)操作步骤进,染色阳性细胞表现为细胞核呈棕褐色,400倍光学显微镜下计数10个视野内的细胞总数,表达指数用百分比表示。

1.6 损伤动脉局部NO含量测定及eNOS mRNA检测 NO含量采用ELISA法测定,严格按照试剂盒(购自上海晶天生物科技有限公司)操作规程进行。利用 RT-PCR检测eNOS mRNA表达。根据文献报道,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。eNOS(599bp)引物序列为:上游:5'-GCCGGATCCTCCAGG AGGGTGTCCACCTG-3',下游:5'-CCGGAATTCGAATACCAGCCTGATCCATGGAA-3'。 以 β-action(540bp)作为内参物,上游:5'-GTGGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3',下游:5'-CTCTT TGATGTCA CGCACGATT TC-3'。PCR条件为:94℃1 min,68℃1 min,72℃3 min,首次循环94℃3 min,共35个循环,结束前72℃25 min,以充分延伸。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙啶染色45 min,反射紫外灯下摄片,光密度扫描,以β-action光密度值作为内参照物,eNOS表达量用二者光密度比值表示。

1.7 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件,组间比较用方差分析,两两比较采用SNK检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 FACS鉴定外周血分离培养的M SCs(见图 1) 可见MSCs均一表达CD44阳性而CD34、CD45阴性,且纯度达95%以上。

图1 FACS检测MSCs细胞表面抗原标记

2.2 颈动脉病理形态学检查 正常情况下,颈动脉内皮光滑,内皮细胞饱满,呈长梭形,长轴与血流方向一致。球囊损伤后4周病理切片扫描电镜观察显示,对照组见颈动脉内皮细胞缺失,部分内皮片状剥脱,局部有微血栓形成,动脉管壁全周明显增厚,管腔狭窄较明显,内膜管腔面可见纤维组织增生形成纤维帽,纤维帽下中膜内可见较多的泡沫细胞沉积,并伴有淡红染无定形物质形成,呈动脉粥样硬化中晚期(纤维斑块-粥样斑块期)改变;MSCs移植组颈动脉内皮细胞少量缺失,但无内皮的片状剥脱,管壁部分区域轻度增厚,管腔轻度狭窄,增厚处中膜可见少量泡沫细胞沉积,部分区域伴少量纤维组织增生,呈动脉粥样硬化早中期(脂纹-纤维斑块期)改变。

2.3 新生内膜及中膜面积测定 与对照组相比较,MSCs移植组新生内膜面积(NEA)和中膜面积(MA)均明显减少(P＜0.05),而两组间新生内膜/中膜面积比差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 MSCs移植组和对照组新生内膜与中膜面积比较(±s)

表1 MSCs移植组和对照组新生内膜与中膜面积比较(±s)

组别 n NEA(mm2) M A(mm2) I/M MSCs移植组 30 0.336±0.018 0.245±0.017 1.371±0.158对照组 18 0.845±0.0461)0.551±0.0241)1.534±0.014与对照组相比较,1)P＜0.05

2.4 细胞增殖程度测定 MSCs移植组细胞核增殖抗原PCNA阳性细胞率显著低于对照组[(0.236±0.014)%vs(0.881±0.017)%,P＜0.05]。

2.5 损伤动脉NO含量及eNOS mRNA表达(见表2) MSCs移植组NO含量和eNOS mRNA表达均明显高于对照组,差异具有统计学意义。同时,eNOS mRNA表达程度与4周时动脉内膜增生情况相关分析显示呈负相关(r=0.943,P＜0.05)。详见表 2。

表2 损伤动脉NO含量及eNOS mRNA表达(±s)

表2 损伤动脉NO含量及eNOS mRNA表达(±s)

组别 n NO含量μ mol/gprot eNOS mRNA%M SCs移植组 30 0.984±0.027 0.871±0.024对照组 18 0.305±0.019 0.291±0.032 P＜0.05 ＜0.05

3 讨 论

冠心病是严重威胁中老年健康的常见疾病,PCI手术作为冠状动脉血运重建的有效手段,有效地解决血管狭窄,缓解心肌缺血导致的心绞痛等症状。然而,球囊扩张及支架植入均可不同程度地造成了血管内膜损伤和撕裂,加重局部炎症反应,导致严重的内皮功能障碍,进而引起一系列级联反应包括平滑肌细胞增殖、迁移及新近内膜增生等病理损伤修复反应,最终导致再狭窄的发生。基础研究表明,MSCs经体外诱导能够向心肌细胞、内皮细胞等方向分化[1-4]。Silva等[5]将标记的MSCs经心肌注射给慢性心肌缺血的犬模型,发现缺血心肌毛细血管密度增加,免疫染色显示增加的毛细血管被覆标记的内皮细胞,证明MSCs有能力分化为内皮细胞,促进血管再内皮化[6,7]。但MSCs在正常人外周循环中含量极少,这种有益的作用不足对抗由于球囊扩张或支架植入引起的内皮损伤和内膜反应性增生。

血管内膜损伤后愈合过程包括内膜撕裂激活血小板和白细胞黏附聚集,释放出大量趋化因子和促有丝分裂因子,进而导致中膜平滑肌细胞增生、迁移至内膜形成新生内膜,最终细胞外基质合成增加,基质沉积增加,导致新生内膜面积扩大。本研究采用经高脂饮食喂养结合氮气损伤制作颈动脉粥样硬化大白兔模型,在此基础上给予球囊损伤。细胞移植4周后病理形态学检查显示,MSCs移植组颈动脉内皮细胞少量缺失,但无内皮的片状剥脱,管壁部分区域轻度增厚,管腔轻度狭窄,增厚处中膜可见少量泡沫细胞沉积,部分区域伴少量纤维组织增生,呈动脉粥样硬化早中期(脂纹-纤维斑块期)改变;而对照组见颈动脉内皮细胞缺失,部分内皮片状剥脱,局部有微血栓形成,动脉管壁全周明显增厚,管腔狭窄较明显,内膜管腔面可见纤维组织增生形成纤维帽,纤维帽下中膜内可见较多的泡沫细胞沉积,并伴有淡红染无定形物质形成,呈动脉粥样硬化中晚期(纤维斑块-粥样斑块期)改变。上述研究结果提示,在损伤血管的病理修复的过程中MSCs移植可能发挥了有益作用。

本研究通过计算机软件分析系统测量了颈动脉新生内膜和中膜面积,结果显示,与对照组相比较,MSCs移植组新生内膜面积和中膜面积均明显减少(P＜0.05);虽然两组间新生内膜面积/中膜面积差异无统计学意义,但与MSCs移植组相比,对照组新生内膜增生程度更为明显。同时血管壁PCNA测定显示MSCs移植组细胞核增殖抗原阳性细胞率显著低于对照组,提示MSCs移植治疗可能显著抑制了新生内膜增生,其在降低损伤动脉壁的细胞增殖和内皮修复中可能发挥重要作用,其机制可能与静脉移植的MSCs归巢至球囊损伤的颈动脉,促进内皮再生,降低局部炎症反应等有关;而内皮结构和功能的恢复能够有效地抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜增生,从而降低再狭窄的发生[8-10]。此外,移植MSCs的旁分泌机制如分泌血管内皮细胞生长因子在抑制局部炎症反应、促进血管生成等方面的有益作用亦可能参与了内皮的修复[11]。

一氧化氮是一种小分子的活性物质,在心血管系统中,NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用,是血管内皮细胞发挥作用的重要分子。同时,NO还可抑制平滑肌细胞激活分裂,作用于许多环节促进凋亡,抑制平滑肌细胞的迁移与增殖。本研究发现,MSCs移植组mRNA表达均明显高于对照组,差异具有统计学意义。同时,eNOS mRNA表达程度与4周时动脉内膜增生情况相关分析显示呈负相关。这提示,MSCs移植治疗后新生内膜增生程度降低可能部分与移植的MSCs重建内皮功能,从而抑制平滑肌细胞迁移和增殖有关。

总之,本研究通过构建接近于临床上冠心病病变后的支架植入治疗模式的大白兔模型,采用MSCs静脉移植治疗,发现其可明显降低球囊损伤后的粥样硬化颈动脉的新生内膜增生,并在一定程度上促进内皮再生和修复,其机制部分与移植的MSCs重建内皮功能有关。此研究结果对临床上血管成形术后防治再狭窄的防治提供了重要的动物实验数据。

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