透明质酸的变温发酵研究＊

吴华昌,徐静,邓静,张伟娜

(四川理工学院生物工程学院,四川自贡,643000)

透明质酸的变温发酵研究＊

吴华昌,徐静,邓静,张伟娜

(四川理工学院生物工程学院,四川自贡,643000)

采用兽疫链球菌进行摇瓶发酵,研究了30～40℃范围内温度对透明质酸(HA)分批发酵的影响,结果表明:34℃时菌体量最大为13.1 g/L,38℃下HA的产量最高为82 mg/100 mL;在此基础上,提出分阶段控制温度策略,通过L18(37)正交实验优化出的最优变温发酵条件是:发酵前期控制温度在34℃,进入稳定期12 h时,改变发酵温度至40℃,在此变温条件下发酵HA的产量可达105.3 mg/100 mL,比38℃恒温发酵提高了28.4%。

透明质酸,变温发酵,兽疫链球菌

透明质酸(hyaluronic acid,简称HA),作为一种国际上公认的生物大分子保湿剂,在医药,化妆品,保健食品等领域有着广泛应用[1-3],其需求量也在不断增加。HA的生产主要有组织提取法和细菌发酵法,发酵法由于原料易得,成本低,有较高的分子量和产量,而逐渐成为生产HA的主要方向,并开展了许多研究工作[4]。

温度对发酵过程的影响是多方面的,主要是影响各种酶反应的速率,影响微生物代谢调控机制,改变菌体代谢产物的合成方向以及影响发酵液的理化性质,进而影响发酵的动力学特性及产物的生物合成[5]。一般而言,最适发酵温度是既适合菌体生长,又适合代谢产物合成的温度,但最适生长温度与最适产物合成温度往往是不一致的[6-7]。本文在前人研究的基础上,首先考察了不同温度对HA分批发酵的影响,确定出最适菌体生长温度和产物形成温度;在此基础上又提出了变温发酵,即在生长阶段选择最适生长温度,以利于菌体迅速生长繁殖,在产物生成阶段选择最适生产温度,以利于产物形成,从而达到高生产强度,高产率和高产量的相对统一。

1 材料与方法

1.1 菌种

兽疫链球菌(Streptococcus zooepidem icus)原始菌株,四川理工学院生物工程学院保藏菌种。

1.2 培养基

斜面培养基:葡萄糖1 g,蛋白胨0.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,琼脂1.5 g,水100 mL,pH 7.0,121℃灭菌30 min。

种子培养基:葡萄糖2 g,酵母膏2.5 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,MnSO4·4 H2O 0.01 g,水100 mL pH 7.0,121℃灭菌30 min。

发酵培养基(%):葡萄糖2,蛋白胨1,酵母膏0.5,KH2PO40.2,MgSO4·7H2O 0.05,pH 7.5,121℃灭菌30 min。

1.3 培养条件

斜面培养:将保藏菌种接入试管斜面培养基中划线培养,37.5℃培养15 h。

种子培养:用5 mL无菌水洗试管斜面,菌液接入摇瓶种,装液量为40 mL/250 mL,在200 r/min,37℃条件下培养12 h。

恒温发酵:装液量为75 mL/500 mL的摇瓶中,接种量1 mL,用摇床在200 r/min,不同温度(30、32、34、36、38、40℃)下培养20 h,其中每隔2h取样测值。

变温发酵:装液量为75 mL/500 mL,接种量1 mL,200 r/min下培养20 h,发酵过程中用2个摇床实现温度的变化。

1.4 分析方法

葡萄糖的测定:DNS法[8],菌体的测定:干重法[9],HA的测定:Bitter-Muir法[10]

2 结果与分析

2.1 温度对HA分批发酵的影响

在不同温度下进行恒温发酵,每隔2 h取样测定发酵液中葡萄糖浓度,菌体干重和HA的含量,结果如图1～图3。

图1 不同温度下葡萄糖的消耗曲线

图2 不同温度下细胞生长曲线

图3 不同温度下HA的生物合成过程曲线

由图1知,30℃下,残糖的浓度较高,其他发酵温度下随着温度的升高,葡萄糖进入快速消耗期的时间提前,而且残糖很少,葡萄糖基本被利用,葡萄糖浓度由最初的2.5%降至0.3%左右。

由图2知,30～40℃,菌体生长曲线良好,有明显的延滞期,对数生长期和稳定期,随着温度的提高,菌体生长的延滞期缩短,进入对数生长期和稳定期的时间提前。30～34℃,16 h时进入稳定期,36～40℃内12 h进入稳定期,提前了4 h左右。由稳定期内各温度的菌体干重知34℃是菌体的最适生长温度,菌体量可达13 g/L。

由图3知,HA的合成曲线与菌体生长曲线偶联,在30～36℃内,随着温度的提高,HA的产量在增加。38℃下发酵进入稳定期之前HA的产量不高,但进入稳定期之后,HA的产量明显提高。38℃时HA的产量最高为82 mg/100 mL,可能是因为在较高温度下,菌体荚膜上的HA更容易脱落,所以产量有所提高。此时HA对葡萄糖的产量系数转化率为34.36 mg/g,生产强度为3.90 mg/(100 mL·h)。

2.2 HA变温发酵条件的确定

以HA产量为指标,采用正交试验对发酵过程中变温前的温度(A),变温时间(B),变温后的温度(C)3个因素的3个水平进行考察。

表1 正交试验因素和水平设计表

变温前的温度,变温时间和变温后的温度这3个因素又相互有影响,就要考虑它们之间的交互作用,试验中就以HA的产量为指标,用L18(37)正交试验设计进行实验,结果见表2。

表2 正交试验结果与分析表

续表2

由因素的影响主次可知,变温时间对变温发酵的影响最大,根据指标越大越好,可以得到优方案为A3B2C2,即变温前的温度为34℃,变温时间是12 h,变温后的温度为40℃,即表2中的8号实验,在该条件下HA的含量达105.30 mg/100 mL,比38℃恒温发酵产量提高了28.4%,此时HA的产率系数为46.39 mg/g,其生产强度为5.27 mg/(100 mL·h)。

以HA为主要指标,用SPSS软件对表2的结果进行方差分析,估计各因素对试验结果影响的重要程度,结果如表3所示。

表3 方差分析表

由方差分析表不仅可以看出各因素的影响主次,根据F值还可以判断出各因素影响的显著性,变温时间对试验的影响非常显著,变温前后的温度对结果的影响显著,交互作用的影响较小。

在最佳变温条件优方案A3B2C2下进行HA变温发酵,变温发酵过程中葡萄糖的消耗,菌体的生长和HA的产生情况如图4。

图4 分段控制温度条件下发酵过程曲线

由图4中HA的生成曲线可以看出,在发酵进入稳定期(12 h)后,改变发酵温度HA的产量有了明显的提高,因为发酵前期温度控制在菌体的最适生长温度34℃上,前期菌体生长状态良好,12 h后改变发酵温度至40℃,不仅可以促进荚膜多糖的脱落,而且HA的溶解度增大,也利于HA的产生。

将图1到图4的试验数据进行整理,得到不同温度下HA分批发酵过程参数,如表4所示。

由表4知,在整个发酵过程中,温度对不同参数的影响是不同的,甚至是相反的。在恒温发酵过程中,细胞平均比生长速率在34℃时达到最大为0.181/h,同时细胞生产强度和产率系数也是最大,HA平均比合成速率在38℃时达到最大为6.2 mg/(g·h),此时的HA生产强度和产率系数也最大。变温发酵与恒温发酵相比,HA的产量,生产强度和产率系数都比38℃恒温发酵提高了25%左右,由此可见在HA发酵过程中采用变温发酵能更好的实现产量,生产强度和产率系数的统一。

表4 不同温度下HA分批发酵过程参数比较

3 结论

在Streptococcus zooepidem icus分批发酵生产HA过程中,相对较低的温度34℃下可以促进细胞生长,菌体浓度可达13.1 g/L,此时菌体对葡萄糖的产量系数为0.58 g/g,而较高温度38℃下HA的产量更高,为82.00 mg/100 mL,生产强度为4.10 mg/(100 mL·h),HA对葡萄糖的产量系数为34.36 mg/g,主要是因为在较高温度下,更多的荚膜多糖脱落,产量提高。通过温度对HA发酵的影响可知,在整个发酵过程中控制单一的温度很难实现促进细胞生长和增加HA合成的统一。

在以生长为主的阶段,选择最适生长温度,以利于菌体迅速生长繁殖,而在产物合成阶段,选择较高温度促进荚膜脱落,产物生成,由此提出了分阶段控制发酵温度的策略。通过正交试验确定出最优的变温发酵条件是:控制发酵前期温度为34℃,发酵至12 h时,改变发酵温度到40℃,此时HA的产量为105.30 mg/100 mL,比38℃恒温发酵提高了28.4%,此时HA的产率系数为46.4 mg/g,其生产强度为5.3 mg/(100 mL·h),由此可见变温发酵过程中生产强度,产率和产量有有所提高,本文提出的分阶段控制温度进行变温发酵是有效的。

[1]凌沛学.透明质酸[M].北京:中国轻工业出版社,2000.

[2]Meyer K,Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor[J].J Biol Chem,1934,107:629-634.

[3]Fong ChongB,Nielsen L K.Amplifying the cellular reduction potential ofStreptococcus zooepidem icus[J].Journal of Biotechnology,2003,100:33-41.

[4]汪嵘,张云开,韦航,等.透明质酸微生物发酵法生产工艺条件的研究[J].广西农业科学,2001,31(4):190-192.

[5]胡雅琴.恒温发酵与高温发酵柠檬酸过程及其比较[J].科技情报开发与经济,2003,13(9):203-204.

[6]鲁晓娟.黑曲霉A25产木聚糖酶的高温发酵研究[D].郑州:河南农业大学,2007.

[7]董云舟,堵国成,陈坚.芽孢杆菌发酵产碱性果胶酶温度控制策略[J].应用于环境生物学报,2005,11(3):359-362.

[8]宋占午,王莱,刘艳玲,等.3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量的条件探讨[J].西北师范大学:自然科学版,1997,33(2):52-55.

[9]梁国庆.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社,1997:198-202.

[10]李薇,佟爱东,邓兆勇.透明质酸化学定量分析方法的研究[J].中国生化药物杂志,1994,15(2):96-99.

ABSTRACTHA batch fermentation process usingStreptococcus zooepidem icuswas discussed under different temperatureswhich were varied from 30℃to 40℃,the results show that the optimal bacterial growth temperature is 34℃and the highest yield up to 82mg/100mL at 38℃.Application of a two-stage temperature control strategy was developed base on those studies.The orthogonal ofL18(37)indicated thatwhen pre-fermentation temperature was controlled at 34℃and changed to 40℃in product synthesis phase,the yield of HA increased to 105.30 mg/100 mL,which is 28.4%higher compared to that of fermentation at single temperature of 38℃.

Key wordshyaluronic acid,variable-temperature fer mentation,Streptococcus zooepidem icus

Application of a Two-Stage Temperature Control Strategy for HA Batch Fermentation Process

Wu Hua-chang,Xu Jing,Deng Jing,ZhangWei-na
(Bio-Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

硕士,副教授。

＊四川省应用基础研究项目(No.2006J13-169)

2009-11-16