蜂王浆中糠氨酸含量测定及其对新鲜度的影响

彭 瑜 陈 坤 徐锦忠 林德祥 何腾飞 吉 翔 王晓平

（1南京老山药业股份有限公司，南京211800；2江苏省蜂业工程技术研究中心，南京211800）

新鲜蜂王浆中含有丰富的生物活性物质，具有增强机体抵抗力，促进组织再生等作用。由于蜂王浆中的一些活性成分对温度和储存时间敏感，因而蜂王浆对贮存条件要求较高，若贮存温度过高或贮存时间过长，其物理性状、化学成分及其品质会发生显著变化。现行的蜂王浆国家质量标准(GB/T 9697-2005)中规定蜂王浆品质的指标癸烯酸非常稳定，即使在高温下也不会大量分解，不适合作为蜂王浆新鲜度以及品质的指标，只能作为蜂王浆是否掺假的评判标准。研究表明[1-3]，糠氨酸可以作为蜂王浆新鲜度的标示物。糠氨酸是英文furosine的中文译名，按照“国际纯粹和应用化学化合物系统命名法”,其学名是ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸。

美拉德反应(MaillardReaction)是食品中的氨基化合物（胺、氨基酸、肽和蛋白质）和羰基化合物（糖类）在食品加工和贮存过程中自然发生的反应。从营养学角度考虑，由于反应使食品中的有效成分如氨基酸类和糖类有损失以及引起食品的褐变等，从而使食品的营养价值部分降低。蜂王浆在加工和储藏过程中，由于发生美拉德反应，不仅其营养物质受到破坏，还产生对人体有害的物质,糠氨酸是美拉德反应所产生的系列产物之一，摄入过量对人体健康有害。

本研究运用蜂王浆美拉德反应机理，以美拉德反应重要产物、糖基化反应非常灵敏的指标“糠氨酸”为标示物，以其在蜂王浆中含量的变化来研究蜂王浆冻干粉的新鲜度。

1 试验材料与方法

1.1原理 美拉德反应(MaillardReaction)使食品中的有效成分如氨基酸类和糖类有所损失并引起食品的褐变等，使食品的营养价值部分降低，在加工和储藏蜂王浆及其制品过程中，由于发生美拉德反应，使其营养物质受到破坏并产生对人体有害的物质。国内外大量文献表明Furosine是反应初级阶段主要产物之一，也是在常温或低温条件下美拉德反应的主要产物，能够反映早期美拉德反应的程度，已被作为很多食品如乳制品等在常温下贮存的货架期指标。本项目Furosine含量利用高效液相色谱（HPLC）紫外检测器在280nm处检测，外标法定量。

1.2 仪器器皿 高效液相色谱仪（Agilent 1100），AgilentCo.Ltd；C18色谱柱 (Kromasil-100A-Spherical Silica，Serial NO B450j1114313)； 鼓 风 干 燥 箱 ：Binder；氮气吹干仪：NENVAP111.Berlin，MA01503 U.S.A；20 孔固相萃取装置：Agilent Technologies；蛋白质测定仪：2300 Kjeltec Analyzer Unit；C18孔固相萃小柱：Supelclean LC-18 SPE Tubes 3 ml.Supelco；带螺盖耐热水解瓶，Waters.

1.3试剂 除另有说明，其他均为分析纯。乙腈（色谱纯）；甲醇；超纯水；浓盐酸；0.1%三氟乙酸溶液：将1mL三氟乙酸（色谱纯）溶于1000 mL水中，用0.45 um滤膜减压过滤。Furosine标准溶液：精密称取2.00 mg Furosine标准品于10 mL 3.0 mol/L盐酸溶液中配置成200μg/mL的标准贮备液（4℃下可保存24个月），分析时取标液1.0 mL，用水定容至10 mL，配置成10μg/mL的furosine溶液。

1.4 样品前处理和测定 由于Furosine在蜂王浆中是以蛋白结合态的形式存在的，要测定它，就必须通过水解使Furosine从蜂王浆蛋白质中游离出来。准确称取0.35g（精确到0.0001 g）蜂王浆，加入10mL 10mol/L盐酸溶液，摇匀，通氮气2min，盖紧螺盖，于110℃烘箱内水解23小时后，冷却，过滤，滤液作为待测溶液。

1.5蛋白质的测定 取0.5 g蜂王浆（精确到0.001 g），加入催化剂，加入14 mL 98%浓硫酸水解后用凯氏定氮仪测定。

1.6糠氨酸的测定

1.6.1 纯化 取0.5mL水解待测溶液过C18固相萃取小柱（萃取柱预先用5mL甲醇和10mL水润湿，并保持水面在固相表面），当液面降至固相表面时，加入3 mL 3.0mol/L盐酸溶液洗脱，收集3mL洗脱液为HPLC上机试液。固相萃取过程中控制流速为1～2滴/s。

1.6.2 HPLC测定 色谱柱：C18 (Kromasil-100ASpherical Silica，Serial NO B450j1114313); 柱 温：20℃;检测波长：280nm；流动相由0.1%三氟乙酸和乙腈组成，在流速0.7mL/min下以梯度方式进行洗脱，梯度程序见表1。

进样量：20uL，外标法定量。

1.7结果计算 蜂王浆样品中糠氨酸含量w计算：

表1 流动相梯度洗脱程序

式中,w为样品中糠氨酸的含量(mg/100g pro)；c为HPLC测得的样品水解液中糠氨酸含量（ug/m L）；D为HPLC测定时样品溶液稀释倍数；m为样品水解液中蛋白质含量（mg/mL）。

1.8试验结果与讨论

1.8.1 标准品与样品HPLC测定 糠氨酸出峰时间在7～9min。标准品与样品HPLC测定结果见图1和图2。

1.8.2 标准工作曲线 配置 0.1、0.25、1.0、2.5、5.0、

10.0、25 .0 μg/mL Furosine标准溶液，以其峰面积（Y）对浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，如图3所示，r=0.99996，表明 furosine在 0.1μg/mL～25 μg/mL 范围内线性良好。平均相对偏差（RSD）＜5%(N=10)。

1.8.3 回收率测定 标准加入法回收率测定为92.5%～105.0%，平均为98.7%。

2 糠氨酸含量对蜂王浆新鲜度的影响研究

为了系统全面地检测蜂王浆受多因素影响下Furosine含量的变化和相关性，现场采集了批号为070606江浦和六合两地各五个蜂场的新鲜蜂王浆，在不同储存温度和时间因素影响下研究其Furosine含量的变化和相关性。经过一年的研究，发现其Furosine含量（每次检测取样为两地的五个蜂场分别各取2份混匀后的样品，测算10份样品的平均值，）随着时间的增长而提高，并且储存温度越高，含量越高。如下图4和图5所示。

3 讨论

经过现阶段蜂王浆新鲜度研究发现，Furosine含量随着时间的增长而提高，并且储存温度越高，含量越高。因此，用Furosine含量能够有效地反映蜂王浆的新鲜度，可以作为评价蜂王浆新鲜度的一个重要指标。由于本研究仅对两地区共十个蜂场的意蜂产的蜂王浆做了研究比较，有待于对不同产地、季节、蜂群的蜂王浆作进一步研究，以确定Furosine是否真正适合作为评价蜂王浆新鲜度的指标。

[1]EMANUELE MARCONI,*MARIA FIORENZA CABONI,MARIA CRISTINA MESSIA,GIANFRANCO PANFILI，Furosine：a Suitable Marker for Assessing the Freshness of Royal Jelly，J.Agric.Food Chem.2002,50,2825-2829。

[2]Asylbek KULMYRZAEV，éric DUFOUR，Determination of lactulose and furosine in milk using front-face fluorescence spectroscopy，Lait 82(2002)725-735。

[3]郑火青，胡福良，李英华．蜂王浆新鲜度指标的研究进展[J]．中国养蜂．2005．56(1 1)：30-31．