小麦籽粒多酚氧化酶活性变化研究

陈 军，高贵珍，曹稳根，马传喜

（1.宿州学院化学与生命科学系，安徽宿州234000；2.安徽农业大学农学院，安徽合肥230036）

小麦生产在我国国民经济中占有重要地位，其中面制食品是我国人民的主食之一。而在面制食品的加工和储藏过程中经常会出现褐变现象。有不少研究表明，小麦中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是影响褐变的主要原因[1～3]。

PPO是一类广泛分布于植物体内能催化多酚类氧化成醌类的质体金属酶，它的底物（酚类物质）存在于液泡中，且这种酶与底物的区域分布使得PPO在完整细胞内的生理功能难以确定。生物体内的PPO分布是不均匀的，具有时间和空间特异性。在小麦中，从幼苗到植株以及成熟籽粒中都含有多酚氧化酶，但种类及活性有所差异。一些研究表明，小麦籽粒中的PPO主要存在于麸皮层中，面粉中PPO活性随着出粉率的增加而提高[4]，且不同小麦类型和品种间PPO均有一定差异；对同一品种而言，发育成熟的大籽粒PPO高于发育不完全的小籽粒。硬粒小麦多酚氧化酶活性最低，普通白粒小麦多酚氧化酶活性低于硬红冬、硬红春及软红冬小麦，但是硬红冬和软红冬小麦、硬红冬和硬红春小麦间多酚氧化酶活性差异较小[5]。大量研究表明，成熟籽粒PPO主要存在于种皮中，胚中无PPO[6，7]，但小麦籽粒发育及萌发过程中PPO动态性的变化规律还不是很清楚。

本研究选取不同类型小麦品种，对籽粒发育及萌发过程中PPO活性进行研究，以期找出小麦籽粒PPO活性变化规律，为小麦PPO遗传改良提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

发育期供试材料为：安农95081-8、安农95083-6-1、安农 0309、郑麦 9023、安农 9267 和烟农19 6个品种，于2006—2007年种植于安徽农业大学试验田。

萌发期供试材料为：宿麦553、徐麦856、皖麦 50、皖麦 52、烟农 19、邯 6172、连麦 2号 7个品种，于2007—2008年种植于宿州市农科所试验田。

以上材料均采用小区撒播种植，田间管理与大田一致。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

1.2.1.1 发育期籽粒的处理 各品种在盛花期选取同时开花且大小一致的200穗挂牌标记。4月28日第1次取样，每品种分别取15穗放于冷冻冰箱（-70℃）中待测。以后每隔5 d取样1次，直至成熟收获。

1.2.1.2 萌发期籽粒的处理 （1）每个品种称取相同质量的籽粒21份，每份1.000 g。（2）将上述样品浸于一个培养皿里，于25℃、空气湿度95%的人工可编程气候箱内培养，且要定时翻动籽粒。（3）萌发期分 7 个阶段取样，即 0，12，24，36，48，60，72 h（每隔 12 h取样1次）。将培养好的小麦籽粒冰浴研碎备用。

1.2.2 PPO活性检测方法

1.2.2.1 发育期籽粒PPO活性检测 参照Anderson[8]和Morris[9]的方法。未成熟籽粒（干质量为0.300 0 g）放于研钵中冰浴研碎后转入50 mL小烧杯中；成熟籽粒用瑞典产旋风磨制备全麦粉（过0.5 mm筛）。称取0.300 0 g全麦粉放入50 mL小烧杯中，加入7.5 mL反应试剂（50 mmol/L，pH=6.5的MOPS缓冲液；10 mmol/L L-DOPA，左旋多巴作为PPO反应底物），恒温水浴振荡器上振荡5 min（振荡器速度设为100 r/min，温度设为37℃），样品充分暴露在空气中，之后迅速将反应后的样品放在冰块上终止反应（1 min），并迅速混匀样品，用中速定量滤纸进行过滤。以反应试剂（空白L-DOPA/MOPS，左旋多巴与MOPS的混合液）为对照，在475 nm下测定滤液的吸光度ΔA（ΔA为5 min内吸光值的变化），每克籽粒每分钟吸光值上升0.001定义为一个酶活单位（单位AU，absorbance unit）。PPO的活性表示为ΔA×103AU/（min·g）。

1.2.2.2 萌发期籽粒PPO活性检测 在比色皿中依次加入2.8 mL磷酸缓冲液，1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚。用移液管加入0.3 mL粗酶液，混匀，迅速放入37℃水浴锅中，水浴5 min后测OD420。每克籽粒每分钟吸光值上升0.001定义为一个酶活单位（单位 AU，absorbance unit）。PPO的活性表示为ΔA×103AU/（min·g）。

1.3 数据分析

运用Excel和SAS统计分析程序对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 PPO活性变异方差分析

由表1可知，基因型与发育时期互作PPO活性变异的方差分析中，籽粒发育的不同阶段PPO活性差异极显著，不同基因型和基因型与发育时期互作PPO活性差异都不显著。因此，基因型对籽粒发育过程中PPO活性不具有显著影响，基因型与发育时期互作对PPO活性也不具有显著影响，而籽粒发育的不同阶段对PPO活性有显著影响，且发育时期间的PPO活性差异远大于品种间的差异。这表明籽粒发育的不同时期是影响PPO活性的主要因素。

表1 基因型与发育时期互作PPO活性变异的方差分析

从不同品种与萌发期互作PPO活性变异方差分析（表2）可看出，品种间PPO活性差异极显著，不同萌发阶段PPO活性差异也达到极显著水平，而品种与萌发期互作PPO活性差异不显著。这表明在小麦籽粒萌发过程中，品种和萌发期对PPO活性都有显著影响。

表2 基因型与萌发期互作PPO活性变异方差分析

2.2 PPO活性的变化

图1结果表明，籽粒发育过程PPO活性变化大致趋势是先降低后升高，但品种间变化幅度不同。安农95083-6-1和安农0309 2个品种开始时PPO活性较高然后大幅度下降，下降后又渐渐升高；安农95081-8、安农9267、烟农19和郑麦9023这4个品种PPO活性的变化趋势较为平缓。

由图2可知，各品种PPO活性的变化趋势和幅度不尽相同，宿麦553变化幅度较小，其余6个品种变化幅度较大；徐麦856 PPO活性变化呈先升高后降低的趋势；连麦2号、邯郸6172、皖麦52 3个品种PPO活性呈升高后降低接着再升高又降低的变化。这说明小麦籽粒萌发过程中PPO活性是不稳定的，但小麦籽粒萌发过程中成熟干籽粒（0 h）PPO活性最低。

3 结论与讨论

小麦籽粒发育及萌发过程中PPO活性呈动态变化趋势，存在着极其复杂的表达调控机制。通过对不同品种PPO活性的研究，不同发育期间的PPO活性差异远大于品种间的差异，籽粒发育过程中不同品种的不同发育时期间PPO活性变异水平不同，其PPO活性变化是开始时较高然后降低接着又升高，不同品种间这种变化幅度不同，一些品种变化幅度较大；萌发过程中PPO活性也是不稳定的，各品种PPO活性的变化趋势和幅度不尽相同，在小麦籽粒萌发过程中品种和萌发期对PPO活性都有显著影响。现已知道PPO是一种质体酶，存在于叶绿体、白色体等质体中，生理状态下与底物严格隔离[10]，但在小麦籽粒萌发过程中，PPO易于释放进而与底物接触，这可能会导致萌发过程PPO活性较高。

一些研究发现，在植物组织或器官中，幼嫩部位的PPO活性较高，而成熟或衰老部位的PPO活性低，但PPO的生理功能还不清楚[11，12]。由于PPO主要位于正常细胞的质体中，其作为氧化还原酶被认为与呼吸链末端电子传递有关，能消除氧自由基的伤害与催化植物或动物的色素形成[13，14]。小麦植株PPO活性因感染病虫而升高，因此PPO可能与植物自身防御功能有关，但缺乏直接的证据。此外，PPO与植物的生长发育可能有关，可促进乙烯的代谢。因此，本研究所得结果的原因可能有2个方面：一是籽粒本身抗性的需要，二是不同品种的小麦表达PPO的水平不同。

大量研究表明，PPO与植物抗病性密切相关，PPO活性升高是小麦抵抗病原侵入和扩展的一种保护反应。然而面制食品需要的是低PPO活性的小麦，以减轻面制食品的褐变，因而，在选育品种时，应选择籽粒发育期PPO活性高成熟后PPO活性低的品种。至于小麦籽粒发育和萌发期PPO活性变化是否存在内在关系，这还有待于进一步研究。但本研究得出的籽粒发育的不同时期是影响PPO活性的主要因素，籽粒萌发过程中品种和萌发期对PPO活性都有显著影响，这一结论可为小麦品质改良提供重要信息。

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