实验动物屏障系统微生物动态状况

柯贤福,周莎桑,楼 琦,卢领群,戴方伟,萨晓婴

(1.浙江大学动物科学学院,杭州 310029;2.浙江省医学科学院省实验动物中心,杭州 310013)

研究报告

实验动物屏障系统微生物动态状况

柯贤福1,2,周莎桑2,楼 琦2,卢领群2,戴方伟2,萨晓婴2

(1.浙江大学动物科学学院,杭州 310029;2.浙江省医学科学院省实验动物中心,杭州 310013)

目的研究运行中的实验动物屏障系统微生物的情况。方法采用沉降菌法、棉拭子法等方法,研究运行中的屏障系统不同区域、不同环境指标下屏障系统内微生物的状况。结果动态下的屏障系统微生物情况与国标 GB14925-2001中静态环境有较大不同,动物饲养室和动物实验室沉降菌浓度远高于静态要求;辅助区域在规范化消毒及严格管理的情况下,能达到国标要求。屏障系统的微生物情况存在一定的昼夜变化规律,在晚间出现峰值。结论合适的换气次数可有效控制实验动物屏障系统的沉降菌浓度;加强消毒及硬件的管理,是屏障系统内环境稳定的保障。

微生物;沉降菌;检测;环境;实验动物

实验动物环境设施的国家标准主要针对的是静态下的实验动物设施[1],而运行中的实验动物设施内微生物的携带情况,国家标准未作明确规定,相关研究也不多见。本研究通过几种不同的方法观察实验动物设施的动态微生物变化情况,以期发现微生物变化的规律并为实验动物设施管理提供依据。

1 材料和方法

1.1 屏障系统设施情况

屏障环境动物实验室,面积 500 m2,单走廊结构。动物实验区共 8个动物实验室,为全新风模式;辅助功能区域包括内准备间、洁具室、清洁走廊、二更、缓冲等,为回风部分再利用模式(图 1)。实验期间,该设施环境参数控制如下:温度 20℃～24℃,相对湿度 60%～70%,噪音 <60 dB,相邻房间梯度压差 15～20 Pa,空气洁净度 7级 (辅助区域),昼夜明暗交替时间 12 h/12h。

图 1 屏障环境动物实验室平面布局图Fig.1 The ichnography of animal lab

1.2 检测仪器和试剂

BCJ-1型激光尘埃粒子计数器 (江苏省吴县市华达仪器设备厂);475-000-FM手持式数字压差计(美国Dwyer);Testo608-H1型温湿度表 (德图仪表有限公司);SPX-150BS-II型生化培养箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司);营养琼脂培养基 (杭州微生物试剂有限公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 棉拭子法:采用拭子法[2],检查屏障系统各个功能区域的墙壁、地面、饲养器械等表面的微生物分布情况。主要包括:一更、二更、鞋柜、无菌衣柜、风淋室、缓冲间、传递窗、内准备间、清洁走廊、动物实验室等。于环境消毒处理前、后分别进行采样。用 5 cm ×5 cm的标准灭菌规格板,放在被检物体表面,采样面积≥100 cm2,连续采样 4个,用浸有含中和剂的无菌洗脱液的棉拭子 1支,在规格板内横竖往返均匀涂擦各 5次,并随之转棉拭子,剪去手接触部位后,将棉拭子投入 10 mL含中和剂的无菌洗脱液试管内,立即送检。

将采样管在混匀器上振荡 20 s或用力振打 80次,用无菌吸管吸取1.0 mL待检样品接种于灭菌平皿,每一样本接种 2个平皿,内加入已溶化的 45℃～48℃的营养琼脂 15～18 mL,边倾注边摇匀,待琼脂凝固,置 37℃培养 48 h,计数菌落数。

1.3.2 沉降菌法:采用沉降菌法,用普通营养琼脂进行落下菌的测定。培养基经过高压灭菌器灭菌后倒入直径 9 cm的一次性平皿内,4℃保存。沉降菌检测时,分别于不同的功能区域摆放平皿,30 min后进行 37℃培养 48 h,计数菌落数。

布点方法:室内面积≤30 m2,设内、中、外对角线 3点,内、外点布点部位距墙壁 1 m处;室内面积>30 m2,设 4角及中央 5点,4角的布点部位距墙壁1 m处。

采样方法:将普通营养琼脂平板放在室内各采样点处,采样时将平板盖打开,扣放于平板旁,暴露30 min,盖好立即送检。采样期间,禁止人员走动。

2 结果

2.1 棉拭子法测试不同区域细菌情况

采用棉拭子的方法,分别于消毒前后从传递仓、内准备间、二更、清洁走廊、沙鼠室、大鼠室及空实验室的墙壁进行采样。动物实验室的墙壁所携带菌落数显著高于辅助区域 (P<0.05);沙鼠实验室的菌落数显著高于大鼠实验室 (P<0.05)。消毒前后的比较,辅助区域菌落数有减少的趋势,而动物实验室则显著降低。空实验室因未饲养动物且保持通风状态,故洁净状态前后较为一致,菌落数较少(表 1)。

表 1 棉拭子法不同区域细菌情况Tab.1 The number of bacteria among different areas by swab test

2.2 沉降菌法消毒前后不同区域菌落数比较

采用沉降菌测试法,连续监测不同区域 (动物实验室、辅助区域)消毒前后的沉降菌浓度变化情况。沙鼠和大鼠实验室的沉降菌浓度随着时间的变化呈现一定的变化规律,均在晚上 21时至 24时出现峰值,且沙鼠实验室的沉降菌数始终高于大鼠实验室 (图 2)。辅助区域在消毒后菌落数有所降低,除清洁走廊外,空实验室、内准备间、二更、缓冲均能始终维持在国标中静态环境所要求的 3 cfu/皿,φ9 cm,30 min以内(图 3)。

图 2 动物实验室沉降菌浓度变化情况Fig.2 Airfall bacteria number of animal lab

图 3 辅助区域沉降菌变化情况Fig.3 Airfall bacteria number of functional areas

2.3 不同换气次数下沉降菌浓度的比较

在保持相同动物密度及梯度压差等指标相对一致的情况下,先后设置动物室换气次数为 10次/h、15次/h,观察各动物实验室及辅助区域沉降菌浓度的变化情况。辅助功能区及空实验室沉降菌浓度未见明显差异,但数量均较少,且在国标范围内;沙鼠室和大鼠室在 15次/h的换气次数下,沉降菌浓度显著降低 (P<0.05)(图 4)。

图 4 不同换气次数下各区域沉降菌情况Fig.4 Airfall bacteria of different ventilation rate among different areas

3 讨论

实验动物的环境是封闭式人工环境,包括气候因素(温度、湿度、风速等)、物理化学因素 (换气次数、尘埃粒子、噪音、照度等)、生物因素 (微生物等)等。实验动物的环境因素对动物实验的结果产生重要的影响。进行动物实验时,为了保证实验结果的稳定性与可靠性,需要尽可能的控制这些影响因素。动物室空气中浮游着通过动物和人或饲养笼器具带进来的细菌、病毒、立克次体等。这些微生物在适当的温、湿度和营养条件下会迅速增殖。病原性微生物污染动物室后,会造成动物繁殖效果差和动物实验的混乱乃至动物死亡。因此,屏障系统的运行过程中,动物进入要先进行检疫,人员进出需洗手、淋浴、更衣,空气则要经过三级过滤,笼器具及实验器材要进行灭菌、消毒后方可使用,即用各种手段防止微生物侵入动物室内,使设施的内环境保持相对独立。

动物室的空气中细菌数目是反应设施中微生物污染程度的一个重要指标。空气中细菌检测分静态和动态两种。设施启用前的沉降菌检测属于静态检测,目的是了解设施是否具备维持饲养动物所需的充分的清洁度的性能。由于是没有饲养动物的状态,故其测定的结果变化因素少[3];而作为饲养动物状态下动物室的洁净情况的检测,动态细菌监测对于了解屏障设施的运行状态,监控内环境的清洁程度有着重要的意义。动态监测是在饲养动物状态下进行的,其测定结果因温度、湿度、换气次数、饲养密度、笼盒结构、垫料、动物活动期、人员工作时期、采样地点等因素的变化而有较大的变动。

通过棉拭子法可看出,动物设施的墙壁及地面附着大量的微生物,尤其是动物饲养室和动物实验室,因为动物的活动,使得微生物数量远多于没有动物的辅助区域。因此,加强对环境的消毒是必要的,且在消毒过程中,不可忽视对墙壁、屋顶的擦拭、喷雾,还应经常用消毒药水拖地,这些部位都是容易滋生细菌的地方。

动物有其较为固定的活动周期,故动物室的沉降菌浓度也随之呈现一定的变化规律。动物晚间活动较为频繁,从而导致夜间动物室的空气质量相对较差,空气中的细菌数也明显增加,尤其是晚上 21时至凌晨零时表现更为突出。此外,在上午工作人员进行实验操作期间,沉降菌浓度也呈现较为明显的升高,几乎达到全天峰值。屏障系统中,人员的进入和操作活动室污染屏障洁净环境的最大污染源[4]。建议考虑在上述时间段采用增加换气次数的方法来改善动物室空气质量,同时便于将大量产生的细菌携带出屏障设施之外,以保证室内的洁净情况。

屏障系统动物实验室多为乱流,其室内气流有一部分要循环流动,因此,动态环境下,乱流屏障系统动物实验室的细菌是较难控制的[5]。适当的增加换气次数,能供给动物新鲜空气,对除去动物室内恶臭物质有重要作用,也与粉尘、微生物的控制有直接联系。15次/h的换气次数下,大鼠实验室、沙鼠实验室的沉降菌浓度分别降低 48.7%、44.7%,因此,建议动物实验室的换气次数应不低于 15次/h。

辅助区域 (二更、缓冲、内准备、清洁走廊)的微生物携带情况远远好于动物实验室,其沉降菌浓度基本均在静态国标要求的 3 cfu/皿以内。这也说明屏障系统通过合理消毒与严格管理,是可以有效保持其微生物洁净状况的。同时可看出,清洁走廊的沉降菌浓度始终高于其它辅助区域,且间断出现超过 3 cfu/皿的情况,初步认为有两方面原因:一是本屏障系统为单走廊结构,污洁的笼具、人员、动物、物品均需通过该区域,从而造成清洁走廊从空间上无法划分洁污流线,只能依靠时间差来区分,势必会造成该区域洁净情况稍差[6];二是该区域与动物实验室相邻,动物室相对于清洁走廊为正压,部分空气会压入到该区域,而室内的沉降菌数远高于走廊,故引起其沉降菌浓度有所增加。但清洁走廊的沉降菌浓度远低于动物室,管理到位的情况下,能控制在较低水平。能否据此将清洁走廊的沉降菌情况作为间接反映实验动物屏障系统动态微生物状况的一个参数,值得进一步的探讨。

[1] 国家质量技术监督局 .GB14925—2001,实验动物环境及设施[S].

[2] 孙俊,周明浩,徐燕,等.消毒技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2003:346-347.

[3] 薛敬礼,杜春燕,王纯耀,等.实验动物环境设施技术指标的探讨[J].中国比较医学杂志,2006,16(6):362-364.

[4] 尹松林,傅江南,王洪军,等.实验动物独立通气笼盒系统设计与应用[M].北京:人民军医出版社,2008:23.

[5] 宗阿南,史晓萍,福山侑荣,等.屏障系统动物室单向流与乱流空气净化方式的细菌比较分析[J].中国比较医学杂志, 2007,17(8):476-477.

[6] 何婧,沈晋明.实验动物设施的污染控制与布局[J].洁净与空调技术,2005,1:34-40.

Dynam ic Status of Germ in Laboratory An imals'Barrier System

KE Xian-fu1,2,ZHOU Sha-sang2,LOU-Qi2,LU Ling-qun2,DA I Fang-wei2,SA Xiao-ying2
(1.College ofAnimal Sciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China; 2.Center ofLaboratoryAnimal,ZhejiangAcademy ofMedical Sciences,Hangzhou 310013,China)

ObjectiveTo study the dynamic situation of ger m about laboratory animals'barrier system。MethodsUsing cotton pledget to test the concentration of bacteria in different area of barrier system,aswell as through themethod of airfall bacteria。ResultsThe results showed that in dynamic enviroment,especially in animal laboratory rooms,the airfall bacteria was farmore than static condition which has been l imited below 3cfu/dish in the National Standards forLaboratory An imal Environment and Facility(GB14925-2001),but in functional rooms the condition was so good that could meet the demand of national standard under the situation that the barrier could be normally sterilized and be managed well.We also found that the airfall bacteria of barrier had regulation that usually had a peak value from 21:00 to 0:00。Conclusions Suitable ventilation rate,possible enviromental disinfection and good management can make the inner environment of laboratory an imal barrier system steady.

Microorganis ms;Airfall bacteria;Test;Enviroment;Laboratory animal

R-33

A

1671-7856(2010)03-0047-04

2009-11-03

浙江省实验动物科技计划项目(编号:2007F80009)。

柯贤福(1980-),男,助理研究员,硕士研究生,研究方向:实验动物质量检测与动物实验。

萨晓婴(1952-),男,研究员,研究方向:实验动物科研及管理。E-mail:saxiaoyin@163.com