栝蒌脱毒苗组培快繁技术体系研究

2010-09-04丁茁荑郑明福杨博智吴艺飞周晓波

湖南农业科学 2010年23期

丁茁荑，郑明福，杨博智，吴艺飞，周晓波

（湖南省蔬菜研究所，湖南省蔬菜工程技术研究中心，湖南长沙 410125）

栝蒌又名瓜蒌、药瓜等，为多年生草质藤本的葫芦科栝蒌属植物，目前主要利用的有栝蒌（Trichosanthes rosthornii Kirilowii Maxim）及双边栝蒌（Trichosanthes rosthornii Harms）。栝蒌的根、籽（果仁）、皮（果皮）均可入药，具有清凉解热、止咳、消肿、治疗糖尿病等多种疾病的功效[1]。近年来，因发现栝蒌籽具有独特的风味和保健作用，被作为一种高档食用瓜子开发进入市场，使得栽培面积急剧增长。

近年来栝蒌在湘南也具有一定的种植规模，并取得了较好的经济效益。农民及栝蒌加工企业对发展栝蒌产业积极性很高，但因种苗问题，严重制约了生产的发展。由于栝蒌种子发芽率低且雌雄异株，种子繁育的苗中只有约30%为可用的雌株，且要在开花后才能辨别，费时费力。同时种子繁殖也易导致品种分离，故主要采取分株无性繁殖的方法，但该法繁殖速度慢，容易导致品种退化和加快病害的传播。

为解决生产中的这一问题，研究组自2005年开始对栝蒌种苗的快繁技术进行了较为全面的研究，建立了其茎尖培养快繁技术体系，有效地解决了这一难题。现繁殖的栝蒌幼苗性状整齐一致，雌株率100%，种苗无病无毒，生活力明显优于分根繁殖苗，已大规模应用于生产。

1 材料与方法

1.1 材料

本次试验样品取自湖南省蔬菜研究所试验田，从中选择人工接种并明显感染黄瓜花叶病毒的植株，剪取其分枝前端。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒与处理（1）预处理：将采回的栝蒌嫩枝条，留腋芽及顶芽，截成2～3 cm长的茎段，先用自来水冲洗2～3次，再用蒸馏水冲洗1次，待用。（2）消毒：70%的乙醇灭菌30 s，3%的次氯酸钠溶液灭菌15 min，无菌水冲洗3～4次。切去切口端少许。（3）预培养：将上述消毒处理好的外植材料接种于MS+6-BA 2.0 mg/L培养基中，约15 d后，腋芽或顶芽生长，形成小苗，备用。

1.2.2 茎尖剥取与培养切取上述小苗茎尖，在解剖镜下用解剖针剥取其分别为0.2、0.5、0.8 mm茎尖各50个以上，接种在不添加激素的MS培养基中培养30 d后，转到MS+2.0 mg 6-BA培养基中继续培养。每瓶2～3个，光照强度为3 000 Lx，光照时间为每天 10 h，温度为（28±2）℃。

1.2.3 黄瓜花叶病毒检测采用王丽花等所述RT—PCR 法[2]。

1.2.4 愈伤组织诱导及增殖培养基的筛选以MS培养基为基本培养基，添加3%白糖（市售）、0.7%琼脂和不同激素浓度配比，pH 5.8（表1）。

表1 诱导愈伤组织培养基不同激素配比（mg/L）

以0.5 cm长茎切段作为外植体接种于上述培养基上，在28℃、光照强度3 000 Lx、光照时间每天12 h的条件下进行愈伤组织诱导培养。

1.2.5 丛生芽诱导培养基的筛选将带有芽点的愈伤组织分割成边长为0.5 cm的小块，分别接种到丛生芽诱导培养基上。丛生芽诱导培养基以MS为基本培养基，添加3%白糖及0.7%琼脂以及不同浓度NAA和6-BA，pH 5.8（表2）。每处理接种愈伤组织25瓶，每瓶4块，培养条件为20℃（夜）～28℃（日）、光照强度3 000 Lx、光照时间每天12 h。观察丛芽发生和生长情况。

表2 丛生芽诱导培养基不同激素配比（mg/L）

1.2.6 继代培养将初代培养出的芽取出，按节切下，接种于继代培养基中，获得发育健壮的栝蒌无根苗。继代培养基设计了两种配方：MS＋6-BA 2.0 mg/L 和 MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，培养条件同上。

1.2.7 生根培养基的筛选以1/MS培养基为基本培养基，3%白糖（市售）、0.7%琼脂，pH 5.8，分别添加0.2、0.4、0.6 mg/L NAA不同激素浓度配比，对照中不加任何激素。每种激素浓度配25瓶培养基。

将继代培养苗按3～4节长切下，接入以上生根培养基中，每处理接种25瓶，每瓶接种苗切断4个，培养条件为18℃（夜）～28℃（日）、光照强度3 000 Lx、光照时间每天12 h。观察统计根的发生和生长情况。

1.2.8 试管苗移栽 15～20 d生根培养后，去培养瓶盖，在室内炼苗2～3 d后，冲洗掉根系上的培养基，移栽至塑料大棚珍珠岩基质中。温度保持23～28℃，白天采用自控微喷系统喷雾保湿，晴天每1～1.5 h喷雾5 min，阴雨天每2～4 h喷雾4 min，3 d后喷雾次数减半，一周后，随着幼苗新根发生，逐步停止喷雾，期间每天喷营养液5 min（1/2园试无土栽培配方）。

1.2.9 栝蒌的扦插试验用插穗有两种：一种取自移栽组培苗，另一种取自大田两年生植株，分别剪取有2～3叶的茎尖或侧枝作为插穗。用0.2%生根粉浸泡插穗，处理时间分别设为：0（不泡生根剂直接扦插）、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

将上述处理过的插穗（每处理200个）分别扦插于珍珠岩基质苗床上，管理方式同试管苗移栽。10 d后观察新根发生情况，每处理随机取样10株测量生根数，取平均值。

1.2.10 育苗大田定植移栽的试管苗或扦插苗根系发育良好后，停止肥水5 d左右炼苗，选择阴天或晴天傍晚，带根定植于大田，密度约4 000株/667m2。

2 结果与分析

2.1 不同茎尖大小成苗率和CMV检出率

接种于不添加激素的MS培养基中培养30 d后，茎尖大多生成愈伤组织，转到MS+2.0 mg 6-BA培养基中继续培养30 d左右后，生长出小苗，其中部分生根。统计其成苗率和取其叶片检测CMV，结果见表3。其中成苗率=（成苗数／接种数）×100%，脱毒率=（1－CMV 检出数／成苗数）×100%。

表3 不同茎尖大小成苗率和CMV检出率

从表3中可以看出，不同茎尖大小的成苗率和病毒检出率差异很大，茎尖越小，成苗率越低，但脱毒效果越好。其中0.8 mm大小的茎尖成苗最为容易，成苗率高达83.7%，但几乎不能脱除病毒，其中只有一株未能检出CMV，脱毒率仅为1.4%。0.5 mm的茎尖成苗率为34.8%，脱毒效果较为明显，达到了29.2%（见图1）。而0.2 mm的茎尖成苗率虽然很低，只有13.7%，但脱毒效果最好，没有检出CMV，脱毒率达到100%。

图1 部分0.5 mm茎尖培养植株CMV RT-PCR检测

为防止连续无性繁殖可能导致的病毒积累而退化的问题，对栝蒌进行脱毒培养是必要的。但栝蒌的主要病毒种类不是很清楚，本试验以大田中感染较为普遍的黄瓜花叶病毒作为标志性病毒，人工接种后，通过检测茎尖培养对黄瓜花叶病毒的脱除效果，来评价整体脱毒效果。茎尖培养脱毒的原因是小茎尖分生组织尚未形成微管束，病毒无法移动感染，因此，在一定大小的茎尖下CMV不能感染，以至其他病毒也不能感染，表明以CMV作为脱毒标志应该是可行的。也就是说，如果该方法能有效脱除黄瓜花叶病毒，那么同样也能脱除其他病毒（如果存在的话）。据此可以认为，采用0.2 mm大小的茎尖培养，能有效脱除栝蒌病毒，获得无病毒苗。

2.2 不同激素配比对栝蒌愈伤组织诱导的影响

栝蒌外植体接种在添加如表1所示不同浓度激素MS培养基上，培养约10 d时，所有培养基上的茎尖和茎切段基部均有淡黄色的愈伤组织形成。继续培养约10 d，形成的愈伤组织开始分化出淡绿色芽点，但不同激素配比培养基培养的效果不同（见表 4）。

表4 不同培养基接种20 d后愈伤组织诱导效果

培养结果表明，添加适宜浓度的NAA有利于愈伤组织的形成，但添加0.5 mg/L与1.0 mg/L的6-BA效果并无明显差异。观察发现，在添加0.4 mg/L和0.6 mg/L NAA的MS培养基上诱导形成的愈伤组织较大，色泽较淡而明亮，是较优激素配比。而较高浓度的NAA则抑制愈伤组织的生长。

2.3 不同激素配比对栝蒌愈伤组织丛生芽诱导培养的影响

将栝蒌0.5 cm大小愈伤组织小块接种到表2所示不同激素配比的MS培养基中，培养10 d后，绝大多数愈伤组织分化出3个左右小芽，各处理间差异不明显。培养20 d后的丛生芽诱导情况见表5。结果表明，Ⅶ号激素配比培养基（6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L）效果最佳，其诱导的丛芽数目相对较多，生长速度快，植株健壮，长势良好（见图2）。

图2 丛生芽诱导效果

当培养基中6-BA浓度较低时，丛生芽生长速度较慢，节间较短；而浓度偏高时，腋芽发育，也抑制丛生芽的生长速度。较低浓度NAA（0.2 mg/L）也有促进丛生芽生长的效果，但浓度较高且6-BA浓度偏低时，愈伤组织生长并分化出根系，丛生芽生长缓慢，节间短缩。

表5 不同激素配比对栝蒌愈伤组织丛生芽的诱导效果

2.4 继代培养效果

有研究表明，组织培养通过愈伤组织分化再诱导成苗，虽然繁殖系数高，但有变异退化的风险。特别是重复地进行诱导愈伤组织—分化—诱导—分化的过程，这种风险将显著增加。

作为工厂化脱毒苗生产，繁殖代数高，为了避免变异退化的风险，选择了利用叶芽增殖的方式，即类似于试管扦插，虽然繁殖系数较低，但加代时间较短，总体增殖速度与愈伤组织培养途径基本相当。

两种配方的继代培养基都表现良好，之间没有明显差异。接种的茎节没有产生大的愈伤组织，而叶芽都萌发生长，幼苗及叶芽健壮无畸变，生活力高（见图3）。幼苗生长速度快，在第15天左右可生长2～3节，即可按单节茎段分切继代，完成一个繁殖周期。

图3 MS+6-BA 2.0 mg/L培养基继代产生的腋芽

因为两种培养基培养效果无明显差异，故选择较为简单的MS+6-BA 2.0 mg/L作为最适继代培养基。

2.5 生根培养效果

1/2 MS添加不同浓度NAA的培养基对栝蒌苗根系诱导效果见表6。

表6 不同激素浓度对栝蒌根系的诱导效果

由表6及图3可知，将无根苗接种到1/2MS+NAA 0.2 mg/L培养基上，单株根分化较多，形成的白色根系较发达，生长旺盛，根毛多，愈伤组织小。随NAA浓度的增加，生根率下降，且不定根根毛较少、不发达、根生长缓慢，短粗，脆而易断，愈伤组织发达，根部分泌物增加。因此，添加0.2 mg/L NAA的MS培养基是最适宜于诱导栝蒌试管苗生根的培养基。

另外，从不同大小外植体诱根效果观察中发现，当外植体幼苗小于3节时，会出现和高浓度NAA类似的诱导效果，即愈伤组织发达，根系短粗而脆，苗生长缓慢。因此，在进行诱根处理时，保证外植体大于3节是非常必要的。

2.6 试管苗移栽与大田定植的成活率

试管生根苗移栽至塑料大棚珍珠岩中，成活率与苗的大小关系较大。据观察，5节以上健壮植株，只要严格按要求操作，移栽成活率即可高达95%以上。3节以下的小苗成活率较低，在50%左右。特别注意的是移栽后前3～5 d，保持湿度是关键。

移栽的试管苗或扦插苗新根大量发生后，停止肥水5 d左右炼苗，选择阴天或晴天傍晚，定植于大田，密度约4 000株/667m2。移栽后15 d左右，植株发生大量新根，并进入快速生长期，炼苗后，可选择阴天或晴天傍晚定植于大田，观察统计成活率在95%左右。

育苗大田定植在4～9月皆可进行，一般7月前定植者，需要控制肥水以避免藤蔓生长过旺。调查表明，肥水较好的田块，种根反而较小，而未施肥灌水地块，种根直径基本在2.5 cm以上。8～9月后定植的田块，则应保证肥水供应，种根直径在2 cm左右。

2.7 插穗及处理方式对扦插生根率的影响

于扦插后10 d，观察插穗生根状况，其结果见表7。

表7 不同插穗及处理方法对扦插生根率的影响

从表7可以看出，不同插穗来源扦插生根能力差异极为显著，来源于组培苗的插穗生根率均高于80%，平均达91.8%，而来源于大田两年生苗的插穗，生根率均低于12%。观察发现，该类插穗切口少有愈伤组织发生，易于褐化腐烂，可能是其木质化程度高，难以分化，且大田中植株病菌较多所致。

以0.2%生根粉浸泡组培苗插穗，不同浸泡时间对插穗根系发生亦有较为明显的影响，其差异主要体现在根量和根系生长活力上，在生根率方面差异不大，基本在90%以上。其中处理1h的效果最好，生根率达到94.5%，根系最为发达，根量多而细长，根毛着生多，根系活力高。浸泡时间过长，发根量稍少，根系生长速率缓慢，根变粗，根毛减少。未用生根剂处理的空白对照（组培苗）生根率也能达到95%，只是根系比较短，根量比较少。

3 总结

根据以上试验结果，就栝蒌无毒苗组培快繁技术体系要点总结如下：

（1）无毒苗获得。选优良单株，取0.2 mm茎尖，于MS培养基（不添加激素）中培养45 d后，转到MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA的培养基中诱导愈伤组织。将愈伤组织分割成0.5 cm的小块，接种到MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的MS丛生芽诱导培养基上，获取大量无毒丛生芽。

（2）无毒苗试管苗继代增殖。将丛生芽按节切段，以MS＋6-BA 2.0 mg/L为培养基，通过叶芽进行重复继代增殖。

（3）生根移栽。将3节以上的继代增殖试管苗于1/2MS+NAA 0.2 mg/L培养基上诱导生根。小苗5节以上时，炼苗2～3 d后，移栽至珍珠岩基质中，温度>15℃，微喷系统喷雾保湿，一周后，随着幼苗新根发生，逐步停止喷雾，期间每天喷雾营养液5 min（1/2园试无土栽培配方）进行叶面施肥。

（4）扦插扩繁。剪取移栽组培苗带有2～3叶的茎尖或侧枝作为插穗，用0.2%生根粉浸泡插穗1 h，扦插于珍珠岩基质苗床上，管理方式同上。

（5）大田定植。扦插20 d左右后，选择阴天或晴天傍晚，带根定植于大田，密度（株行距）30 cm×30 cm。一般7月前定植者，需要控制肥水以避免藤蔓生长过旺，8～9月后定植的田块，则应保证肥水供应。待12月地上部枯死后，挖出种根，阳光下晒2～3 d 后，室内储存。

本研究的特点是用茎尖培养脱除病毒后，利用腋芽进行继代增殖，尽可能防止退化变异。组培苗采用扦插扩繁，大大降低了成本。目前该栝蒌脱毒苗繁育体系已经运转4 a，累计推广脱毒苗近30万株，田间普遍表现生长势旺盛，单株结果数明显高于多年生苗和实生苗，受到广大栝蒌种植户的欢迎。

[1]黄璐琦，杨滨，崇熙，等.栝蒌属药用植物资源调查[J].中国中药杂志，1995，20（4）：195-196.

[2]王丽花，瞿素萍，杨秀梅，等.百合上黄瓜花叶病毒的一步RT-PCR 检测[J].天津农学院学报，2007，14（4）:9-12.

[3]杨廷桢，高敬东，杨明霞，等.栝蒌的经济价值及栽培技术要点[J].甘肃农业科技，2003，（10）：48-49.

[4]刘小琴.籽用瓜蒌高产栽培技术要点[J].河南农业科学，2005，（2）：74.

[5]刘志强，童恩预.栝蒌的快速繁殖研究（1）[J].河南师范大学学报（自然科学版），1992，20（4）：130.

[6]佟宏霞，李喜文.栝蒌组织培养和植株再生研究[J].中国中药杂志，1996，21（12）：721-722.

[7]曹孟德，陈辉，王君健.栝蒌的快速繁殖及愈伤组织的诱导[J].生物技术，1996，6（4）：15-17.