香青兰总黄酮对大鼠离体胸主动脉的舒张作用

杨彩玉，安希文，付 伟，王 婷,

安晓晶1，王振华1，郑秋生1

1.石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆石河子 832002；

2.河北省故城县中医院，河北郑口 253800

香青兰总黄酮对大鼠离体胸主动脉的舒张作用

杨彩玉1，安希文2，付 伟1，王 婷1,

安晓晶1，王振华1，郑秋生1

1.石河子大学药学院新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆石河子 832002；

2.河北省故城县中医院，河北郑口 253800

香青兰（Dracocephalum Moldavica L.）为传统维吾尔族药材，具有补益心脑之功效，现代研究表明其对冠心病、心绞痛等病具有治疗作用。该文作者采用大鼠离体胸主动脉灌流技术，观察了香青兰总黄酮的血管舒张作用，旨在为阐明其活性物质基础和作用机制提供依据。结果表明：1）10.0～40.0 mg/L香青兰总黄酮对内皮完整和去内皮大鼠主动脉环的基础张力没有明显影响。2）10.0～40.0 mg/L香青兰总黄酮对去甲肾上腺素（NE，10 μmol/L）所致的内皮完整和去内皮血管均有浓度依赖性的舒张作用，对内皮完整血管的舒张作用更强；一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯L-NAME（0.1 mmol/L）、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝（10 μmol/L）和环氧合酶抑制剂吲哚美辛（10 μmol/L）预处理均可一定程度上抑制香青兰总黄酮的血管舒张作用，表明血管内皮合成的一氧化氮（NO）信号通路和前列环素（PGI2）信号通路参与了香青兰总黄酮的血管舒张作用。3）香青兰总黄酮预处理去内皮血管环可以抑制细胞外钙内流所致的血管收缩，但对细胞内钙释放所致的血管收缩没有影响，香青兰总黄酮对高钾（60 mmol/L KCl）所致血管收缩没有明显影响，表明香青兰总黄酮可抑制血管平滑肌细胞的受体依赖性钙通道，阻止细胞外钙内流，从而可舒张血管。上述结果表明，香青兰总黄酮一方面可通过活化内皮依赖性的NO和PGI2通路舒张血管，另一方面通过抑制血管平滑肌细胞膜上受体依赖性钙通道产生血管舒张作用。香青兰总黄酮多靶点的扩血管作用可能是香青兰治疗心脏病的机制之一。

香青兰；总黄酮；血管舒张；钙通道；血管内皮

0 引 言

香青兰（Dracocephalum Moldavica L.）为唇形科一年生草本植物，其干燥地上部分是维吾尔民族习用药材，名为巴迪然吉布亚，《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔标准（1999年版）》收载了其单方提取物制备的制剂“益心巴迪然吉布亚颗粒”，其具有“补益心脑、利尿、止喘”的功效，“用于神疲失眠、心烦气喘、神经衰弱”等症的治疗。现代药理学研究表明，香青兰对异丙肾上腺素诱发的小鼠心肌缺血损伤有保护作用[1]，临床研究也表明，香青兰对冠心病、心绞痛有一定治疗作用，且具有降低胆固醇、改善血脂异常的作用[2]。目前，香青兰药理活性的作用机制和物质基础仍不清楚，本研究观察了香青兰总黄酮对大鼠离体胸主动环舒张功能，并探讨了其作用机制，旨在为香青兰的临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 药材与试剂

香青兰购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，经鉴定为香青兰（Dracocephalum Moldavica L.）地上部分。按文献所述方法[3]制备香青兰总黄酮（DTF），比色法测定其纯度为87.4%。

左旋硝基精氨酸甲酯 〔N(omega)-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME〕、亚甲蓝（Methyleneblue）、吲哚美辛（Indomethacine）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）均为Sigma公司产品。其余试剂为国产市售分析纯。本研究所用试剂均以Millipore Milli-Q超纯水配制。

K-H 液（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，glucose 5.5，CaCl22.5。临用前配制，0.22 μm除菌滤膜过滤后使用。

1.2 大鼠胸主动脉环的准备

方法如文献[4]所述。实验用雄性SD大鼠购自新疆医科大学实验动物中心（合格证号：SCKX新2003-009），体重250～300 g，10%水合氯醛（350 mg/kg，ip）麻醉后，迅速游离胸主动脉,置于通以95%O2+5%CO2混合气体的4℃ K-H液中，剔除周围组织，将血管条剪成约3～4 mm宽的血管环，避免过度牵拉以损伤内皮。根据实验需要，用棉签磨擦血管环内表面，以去除内皮细胞。将血管环一端固定，一端连接张力换能器，放入含K-H液的浴槽内，持续通以95%O2+5%CO2的混合气体，将静息张力调至2.0 g，使用BIOPAC（MP150型，USA）多道生理记录仪记录血管环的张力变化。在37℃下稳定90 min，期间每20 min换液一次。

用KCl（60 mmol/L）重复刺激3次，以诱发血管的最大收缩幅度。用ACh检验血管内皮活性，待动脉环稳定后，换液一次，浴槽中加入10 μmol/L去甲肾上腺素（NE），收缩达峰值15 min后，加入10 μmol/L Ach检验血管内皮完整程度（预收缩的血管舒张程度大于90%，可认为内皮完整，舒张程度小于10%则认为去除内皮成功）。

1.3 实验方案

血管环基础张力的测定方法如文献所述[4]。

香青兰总黄酮对血管环基础张力的影响：当内皮完整或去除内皮的血管环在静息状态下稳定后，采用累积加药方法，每隔10 min加入香青兰总黄酮（10 mg/mL，预先溶于K-H液），使灌流液中香青兰总黄酮浓度分别达10、20、30、40 mg/L，记录血管环张力变化，对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。

香青兰总黄酮对KCl、NE预收缩的血管环张力的影响：当内皮完整或去除内皮的血管环达稳定状态，分别用KCl（60 mmol/L）或NE（10 μmol/L）预收缩血管达稳态后，按上述累积加药方法，观察香青兰总黄酮对KCl或NE预收缩内皮完整或去内皮血管环张力的影响，对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。

L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛对香青兰总黄酮作用的影响：内皮完整的血管环分别用0.1 mmol/L L-NAME、10 μmol/L亚甲蓝预处理15 min，10 μmol/L吲哚美辛预处理20 min，再加入NE(10 μmol/L)预收缩血管达稳态后，按上述累积加药方法观察香青兰总黄酮对血管张力的影响，对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮。

香青兰总黄酮对外Ca2+内流引起血管收缩的影响：按文献[5]方法使去内皮血管环稳定后，换成无钙K-H溶液稳定10 min，加入NE(10 μmol/L)孵浴20 min，加入40 mg/L的香青兰总黄酮孵育10 min(对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮)，然后逐步加入CaCl2至3 mmol/L，观察香青兰总黄酮预处理对血管环张力变化的影响。

香青兰总黄酮对内Ca2+释放引起血管收缩的影响：按文献[5]方法使去内皮血管环稳定后，用K-H溶液孵浴血管环40 min，换无钙K-H液继续孵浴15 min，加入NE至终浓度为10 μmol/L，使血管收缩，记录最大张力变化幅度值作为相收缩幅度1(Con1)。待收缩稳定后换用含钙K-H液孵浴40 min，其间更换K-H液3次，至血管条达基础张力，再换无钙K-H液孵浴5 min，更换新的无钙K-H液后加入香青兰总黄酮 (至终浓度为40 mg/L)孵浴10 min(对照组加入等体积K-H液代替香青兰总黄酮)，加入NE(至终浓度为10 μmol/L)收缩血管，记录最大张力变化幅度作为相收缩幅度2(Con2)。以香青兰总黄酮处理组与对照组间Con2/Con1×100%的差别，反映香青兰总黄酮对细胞内钙释放引起血管收缩的影响。

1.4 结果与统计分析

上述实验均重复8次，实验结果均以NE(10 μmol/L)或KCl(60 mmol/L)诱发的最大收缩幅度为100%，药物处理后的血管张力幅度变化以其百分率表示。所有数据均以mean±SD表示，采用SPSS10.0统计分析软件，以ANOVA中t检验 (Newman-Keuls法)进行显著性检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 香青兰总黄酮对血管基础张力的影响

与空白对照组比较，香青兰总黄酮浓度累加至40 mg/L，对内皮完整和去内皮血管环张力未见明显影响 (P＞0.05，图1)，表明香青兰总黄酮不影响血管本身基础张力。

图1 香青兰总黄酮对血管基础张力的影响(A)内皮完整血管环；(B)去内皮血管环Fig.1 Effectoftotalflavonoids from Dracocephalum moldavicaL.(DTF)on basic tension of endothelium-intact or denuded aortic rings (A)With endothelium;(B)Without endothelium

2.2 香青兰总黄酮对KCl预收缩血管张力的影响

与空白对照组比较，香青兰总黄酮浓度累加至40 mg/L，对KCl(60 mmol/L)预收缩内皮完整和去内皮血管环张力未见明显影响 (P＞0.05，图2)，表明香青兰总黄酮对电压依赖性钙通道开放所致细胞内钙释放引起的血管收缩没有影响。

图2 香青兰总黄酮对KCl(60 mmol/L)预收缩血管张力的影响 (A)内皮完整血管环；(B)去内皮血管环Fig.2 Effect of total flavonoids from Dracocephalum moldavicaL.(DTF)on KCl(60 mmol/L)precontracted rat aortic rings (A) With endothelium;(B)Without endothelium

2.3 香青兰总黄酮对去甲肾上腺素预收缩血管环张力的影响

NE(10 μmol/L)可使内皮完整和去内皮血管环收缩，香青兰总黄酮可浓度依赖性地使NE预收缩的内皮完整主动脉血管环显著舒张，香青兰总黄酮也可浓度依赖性地使NE预收缩的去内皮血管舒张，但作用强度不及内皮完整的血管环 (图3)。表明香青兰总黄酮诱导的血管舒张更大程度上依赖于血管内皮的完整性。

图3 香青兰总黄酮(DTF)对去甲肾上腺素(10－5mol/L)预收缩血管环张力的影响 ＋E代表内皮完整血管环；－E代表无内皮血管环.#P＜0.05,##P＜0.01 vs对照组;**P＜0.01 vs DTF处理去内皮组Fig.3 Vasodilative effectof total flavonoids fromDracocephalum moldavicaL.(DTF)on norepinephrine(NE,10－5mol/L)precontracted rat aortic rings ＋E means in aortic rings with endothelium;－E means in aortic rings without endothelium.#P＜0.05，##P＜0.01 vscontrol group;**P＜0.01 vs DTF treated(－E)group

2.4 L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛对香青兰总黄酮舒张血管作用的影响

采用一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NAME（0.1 mmol/L）、鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝（10 μmol/L）和环氧合酶抑制剂吲哚美辛（10 μmol/L）预处理内皮完整血管环，均可一定程度上抑制香青兰总黄酮所致的NE预收缩血管舒张，但均未能完全抑制香青兰总黄酮所致血管舒张（图4），表明香青兰总黄酮可通过活化内皮依赖性的NO和PGI2通路舒张血管。

图4 L-NAME(10－4mol/L)、亚甲蓝(10－5mol/L)和吲哚美辛(10－5mol/L)对香青兰总黄酮(DTF)舒张血管作用的影响##P＜0.01 vs对照组;**P＜0.01 vs DTF处理组Fig.4 Effects of NG-nitro-L-arginine methylester(L-NAME) (10－4mol/L),methylene blue (10－5mol/L) and indometacin (10－5mol/L) pretreatmenton vasodilative efficacy of total flavonoids from Dracocephalum moldavica L. (DTF) in endothelium-intact rat aortic rings##P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs DTF treated group

2.5 香青兰总黄酮对外钙内流和内钙释放所致血管收缩的影响

采用去内皮血管环观察了香青兰总黄酮（40 mg/L）预处理对细胞外钙所致血管收缩的影响，结果表明香青兰总黄酮可明显抑制细胞外钙所致的血管收缩作用（图5），说明香青兰总黄酮可通过抑制外钙内流，从而抑制血管平滑肌细胞收缩。

通过观察香青兰总黄酮处理前后细胞内钙释放所致去内皮血管收缩幅度表明，香青兰总黄酮处理对细胞内钙释放所致的收缩与空白对照组没有明显差异（71.3±2.60 vs 72.34±2.85，P＞0.05），表明香青兰总黄酮对内钙释放所致血管收缩没有影响。

3 讨 论

血管张力的大小直接影响外周血液循环的阻力，从而影响血压和心脏负荷水平，血管扩张剂可以改善冠心病或心力衰竭时的心脏供血，减少心脏做功，成为临床重要的治疗手段之一[5]。本实验采用大鼠离体胸主动脉灌流技术，观察香青兰总黄酮对血管张力的影响，发现香青兰总黄酮对去甲肾上腺素预收缩的内皮完整和去内皮血管均有舒张作用，而对内皮完整血管的舒张作用更强，表明香青兰总黄酮舒张血管作用更大程度上依赖于血管内皮。去甲肾上腺素（NE）主要作用于血管平滑肌细胞α1肾上腺素受体，激活磷脂酶C信号通路，一方面活化细胞膜上受体依赖性钙通道（ROC）和电压依赖性钙通道（VOC）的开放，增加细胞外钙的摄取；另一方面刺激细胞内钙释放，从而导致血管收缩。血管内皮作为调节血管张力最主要的组织结构之一，可通过合成并分泌内皮依赖性舒张因子——一氧化氮（NO）和前列环素（PGI2），作用于血管平滑肌细胞，前者通过活化血管平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶，活化cGMP依赖信号通路而舒张血管平滑肌，后者激活平滑肌细胞内cAMP依赖的信号通路导致血管舒张[6]。在NE预收缩的内皮完整血管环上，NO合酶抑制剂L-NAME和环氧合酶抑制剂吲哚美辛均可一定程度地抑制香青兰总黄酮的血管舒张作用，但并未完全抑制香青兰总黄酮的作用，表明NO和PGI2信号通路均参与了香青兰总黄酮对内皮完整血管的舒张作用，但香青兰总黄酮的舒张血管作用尚有其他途径参与。

在去内皮血管环中，NE诱导的血管收缩主要与血管平滑肌细胞外钙内流和内钙释放有关。本实验采用无内皮血管环研究发现，香青兰总黄酮预处理可抑制外钙内流引起的血管收缩。细胞外高钾可造成血管平滑肌细胞膜电位去极化激活VOC，导致细胞外钙内流而引起血管收缩，本实验中香青兰总黄酮对高钾所致动脉环收缩没有明显影响，表明香青兰总黄酮的血管舒张作用与VOC活化无关，进一步研究发现，去内皮血管中香青兰总黄酮预处理对内钙释放所致血管收缩也没有明显影响。上述结果表明，香青兰总黄酮主要通过抑制ROC，抑制了平滑肌细胞的外钙内流所致的血管收缩。

香青兰作为传统维吾尔族药物中重要的“补益心脑”类药物，经过长期的临床实践检验，具有较高的安全性，现代药理学研究也表明其对心血管疾病有确切疗效[1,2]。本研究发现香青兰总黄酮具有较强的舒张血管作用，一方面与其作用于血管内皮细胞的一氧化氮合酶和环氧合酶有关，另一方面可能与其直接抑制血管平滑肌受体依赖性钙通道有关。上述结果表明，香青兰总黄酮可通过多靶点作用方式以扩张血管，香青兰总黄酮可能是香青兰治疗心血管疾病的主要有效部位，有望被开发成一种新型的血管扩张剂。

参考文献：

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[3]张 丽，贺金华，王新堂.香青兰中总黄酮的纯化与含量测定.新疆中医药,2009,27(2)：67～69 ZHANG L,HE JH,WANG XT.Xinjiang J Tradi Chin Med,2009,27(2)：67～69

[4]Li J,Li W,AlturaBT,AlturaBM.Peroxynitrite-induced relaxation in isolated rat aortic ringsand mechanismsof action.Toxicol Appl Pharmacol,2005,209(3)：269～276

[5]严松彪，陈 晖，沈潞华.血管扩张剂在急性心力衰竭中的应用.中华老年多器官疾病杂志，2007,6(2)：83～87 YAN SB,CHEN H,SHEN LH.Application of vasodilator in acute heart failure therapy.Chin J Mult Organ Dis Elderly,2007,6(2)：83～87

[6] 屈宝泽，王化洲.血管内皮功能与冠心病发生与发展.中国临床康复,2005,9(35)：132～134 QU BZ，WANG HZ. Vascularendothelial function in relation to occurrence and development of coronary heart disease.Chin J Clin Rehab,2005,9(35)：132～134

This work was supported by grants from Doctor's Special Fund of Xinjiang Production and Construction Corps(2008GC-12);Key Technologies Research and Development Program of Xinjiang Production and Construction Corps(2007GG23)

Vasodilative Effect ofDracocephalum moldavicaL.Total Flavonoids in Isolated Rat Aortic Rings

YANG Caiyu1,AN Xiwen2,FU Wei1,WANG Ting1,AN Xiaojing1,WANG Zhenhua1,ZHENG Qiusheng1
School of pharmacy,Shihezi University,Shihezi 832002;
Gucheng hospital of Traditional Chinese Medicine,Hebei Gucheng 253800

Mar 25,2010 Accepted：Apr 13,2010

WANG Zhenhua,Tel：+86(993)2057003,E-mail：zhenhuawang@tom.com

Dracocephalum moldavicaL.is a traditional Uygur medicine and has been used widely to benefit heart and brain,with strong cardioprotective effect.However,the molecular basis and mechanisms of its efficacy are not known.Here the vasodilative effect of total flavonoids(DTF)fromDracocephalum moldavica L.on isolated rat aortic rings with or without endothelium was investigated.In the absence of any vasoactive agent，DTF failed to alter basal tension of aortic rings. WhereasDTF (from 10 to 40 mg/L) elicited concentration-dependent relaxation in norepinephrine (NE，10－5mol/L)-pre-contracted aortic rings with or without endothelium,and endothelium removal largely abolished the vasodilative effect of DTF.No effect of DTF was found on KCl-pre-contracted (60 mmol/L)endothelium-intact or denuded aortic rings.The nitric oxide(NO)synthaseinhibitor NG-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) (10－4mol/L),guanylate cyclase inhibitor methylene blue(10－5mol/L),and cyclooxygenase(an enzyme for synthesis prostacycline)inhibitor indomethacin(10－5mol/L)significantly inhibited DTF vasodilative effect on endothelium-intact aortic rings,which proved thatNO and prostacycline pathways were involved in DTF's vasodilative effect. DTF pretreatment(40 mg/L)significantly inhibited extracellular Ca2+influx switched aortic contraction,but had no effect on PE-induced transient contraction through Ca2+release from sarcoplasmic reticulum.Those new findings implied that DTF induced both endothelium-dependent and independent relaxation.Moreover,NO and prostacycline mediated pathways are likely involved in endothelium-dependent relaxation,whereas,inhibition of receptor-operated Ca2+channel contributes,at least in part,to endothelium-independent relaxation.

Dracocephalum moldavica L.; Totalflavonoids; Vasodilative effect; Calcium channel;Eendothelium

2010-03-25；接受日期：2010-04-13

新疆生产建设兵团博士资金项目(2008GC-12)；新疆生产建设兵团科技攻关计划(2007GG23)

王振华，电话：(0993)2057003，E-mail：zhenhuawang@tom.com

Q463，R282.715