Nogo-A及其受体与癫痫大鼠海马苔藓纤维发芽的关系

杨 雷, 赵世刚, 刘 罡, 冯冠青

苔藓纤维发芽(mossy fiber sprouting,MFS)是癫痫导致海马损伤过程中最主要的病理改变,有研究表明,由于海马 MFS引起的突触重组导致了海马内回返性兴奋性环路的形成,促使海马内兴奋性增高,使癫痫易感性进一步增强,进而导致了癫痫的反复发作和长期维持。因此,海马 MFS在癫痫发生、发展的病理生理机制中具有重要意义[1,2]。

Nogo-A是在最近的研究中发现的在中枢神经系统外伤后具有轴突再生抑制作用的因子,被称为髓鞘相关蛋白(MAP)[3]。2000年 Schwab等成功地分离 Nogo-A并克隆出 Nogo基因[4,5],Nogo基因的表达产物有 3种:即 Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C[6～11]。这当中因为 Nogo-A只在中枢神经系统内存在,体外培养具有很强的神经轴突抑制活性而倍受关注。NgR是一种功能性细胞表面受体,能与 Nogo-A羧基端抑制性功能域 Nogo-66特异性结合,形成一种蛋白复合体,介导 Nogo-66的抑制作用[8]。

本文采用免疫细胞化学方法检测癫痫大鼠海马内 Nogo-A及 NgR蛋白表达水平,应用 Timm's硫化银染色方法观察大鼠海马齿状回内苔藓纤维发芽情况,探讨在海马 MF突触重组过程中 Nogo-A及 NgR的可能功能意义,以进一步揭示海马 MF突触重组过程与 Nogo-A及 NgR的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 本研究所用的动物 Wister大鼠由内蒙古大学实验动物研究中心提供,均为雄性,饲养在安静的环境中。本研究所用的试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 动物取材 (1)大鼠称重后,麻醉下经左心插管,依次输入生理盐水 150ml,0.37%Na2S 200ml(Timm's硫化银染色用),4%多聚甲醛 250ml,至四肢僵硬,尾巴变直,立即在室温下取脑,放入多聚甲醛液中后固定过夜,次日至 30%蔗糖溶液中置换固定液约 24h,用 OCT包埋后放入用液氮预冷的正己烷中速冻约 20s,取出后用锡纸包好放入 -20℃冰箱备用。(2)标本移至冰冻切片机,分别按 14μm和 25μm两种厚度留取脑片,-20℃冰箱保存。

1.2.2 染色方法 免疫组化染色方法:大鼠脑切片分为实验组和对照组,分别进行免疫组织化学染色。实验组染色步骤如下:切片经过微波修复和3%H2O2和 5%的正常山羊血清孵育处理后,实验组切片分别加入兔抗 Nogo-A抗体(1∶50)或兔抗NgR抗体(1∶50),4℃冰箱过夜,然后加入生物素标记的二抗室温孵育 10min,链霉素过氧化物酶复合物工作液 10min。以上各步骤之间均用 0.01mol/L PBS缓冲液洗片,5min×3次。滴加新鲜配制的DAB工作液显微镜下观察 5min,自来水冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片。对照组取一套与实验组相邻的切片以正常兔血清替代一抗进行免疫组织化学反应。

Timm硫化银染色方法[7]将贴有脑切片的载玻片放入 Timm显影液中,在暗室内 26℃条件下显影时间为 60～80min,然后将载玻片取出,立即用自来水冲洗 5min,终止反应,然后用双蒸水冲洗,脱水,透明,树胶封片。Timm显影液构成:(1)500g/L-1阿拉伯胶溶液;(2)柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸钠 +柠檬酸);(3)氢醌溶液(1.7克氢醌溶于 30ml蒸馏水);将上述 3种溶液混匀后于临用时再加入 170g/L-1硝酸银溶液 0.5ml即可。

1.3 结果分析及统计学处理 免疫组化染色结果:采用计算机显微图像分析系统测定脑片上的海马各个区域颗粒细胞及锥体细胞的平均灰度值(棕黄色处),灰度值大(染色强度弱、透光强)蛋白表达少,反之则表达多。Timm硫化银染色结果:根据显微镜下海马齿状回内分子层(innermolecular layer,IML)异常 Timm染色颗粒的浓密程度,将海马 MF发芽按以下标准进行半定量评分[8]:0分,在IML内无 Timm染色颗粒;1分,在 IML内有少量散在的斑片状分布的 Timm颗粒;2分,在 IML内有较多的斑片状 Timm颗粒;3分,在 IML内 Timm染色颗粒近于连续分布;4分,在 IML内较浓密的 Timm颗粒带,连续或近于连续分布;5分,连续、浓密、呈层状分布的 Timm颗粒带。统计方法:免疫组化结果进行 t检验、方差分析;Timm's硫化银染色结果采用非参数秩和检验,检验水准:α=0.05。

2 结 果

免疫组化染色结果显示:成年大鼠脑切片经Nogo-A及 NgR蛋白免疫组织化学染色后,在成年大鼠海马神经元中出现极强的免疫反应性,阳性物质呈棕黄色。海马的锥体细胞及颗粒细胞高倍显微镜下可见 Nogo-A及 NgR免疫反应阳性物质不仅存在于神经元胞浆、突起内,而且存在于神经元胞核,且胞核免疫阳性反应最强。将免疫组化染色脑片利用显微图像分析系统对海马各区进行平均灰度值测定,结果发现,实验组 Nogo-A蛋白表达与对照组相比,统计学结果无显著性差异(P＞0.05)(见表1),而实验组 NgR蛋白表达呈现先降低,后升高的趋势,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)(见表2)。

Timm's硫化银染色结果显示:最早在造模后 2w可见海马苔藓状纤维发芽,染色结果为淡染,即在海马齿状回内分子层(IML)有少量散在的斑片状分布的 Timm颗粒;至造模后 2个月发芽脑片染色为深染,即在海马齿状回 IML内有连续、浓密、呈层状分布的 Timm颗粒带。Timm染色半定量评分的结果显示:随着造模时间的延长,Timm染色半定量评分逐渐增高,至造模第 42天,Timm染色半定量评分达 5分。

表1 大鼠KA模型及对照组海马各区Nogo-A蛋白表达(灰度值 ×100,±s,n=24)的比较

表1 大鼠KA模型及对照组海马各区Nogo-A蛋白表达(灰度值 ×100,±s,n=24)的比较

对照组实验 1组实验 2组实验 3组实验 4组33.47±2.4234.74±1.5234.89±1.2333.61±1.5832.92±2.2137.52±1.2135.89±1.8537.31±2.0136.66±1.7437.74±2.6940.28±2.4939.05±2.2838.01±1.7540.89±3.3238.22±2.30

表2 大鼠KA模型及对照组海马各区NgR蛋白表达(灰度值×100,±s,n=24)的比较

表2 大鼠KA模型及对照组海马各区NgR蛋白表达(灰度值×100,±s,n=24)的比较

与正常对照组比较*P＜0.05;与正常对照组比较**P＜0.01

对照组实验 1组实验 2组实验 3组实验 4组28.16±1.2442.27±1.89**37.80±1.52**32.19±2.58**27.90±2.0134.09±3.0440.89±2.46**37.15±3.27*36.07±2.3534.58±1.7240.40±3.3436.39±3.7839.40±2.3742.41±4.0141.39±4.77

3 讨 论

海马苔藓状纤维发芽(mossy fiber sprouting,MFS)是癫痫时普遍存在的病理现象,海马内 MFS所导致的突触重组是癫痫病理生理过程中的一个非常重要的变化,它对于癫痫的发生和发展具有很重要的意义,但导致 MFS的机制至今不明。大脑可塑性与癫痫的关系已受到各国学者的普遍关注,海马颗粒细胞苔藓纤维发芽作为颞叶癫痫海马可塑性改变的最主要特征,更是受到了特别的重视[12～18],近年对海马 MFS产生机制及其与颞叶癫痫的关系进行了广泛的研究,有关 MFS产生机制,目前多数学者认为,海马神经元特别是门区及 CA3区细胞死亡是诱发 MFS的关键因素[4,8,16～18]。正常情况下,齿状回颗粒细胞发出苔藓纤维与门区中间神经元及 CA3区锥体细胞树突建立神经联系,而齿状回内分子层接受 CA3区锥体细胞和门区神经元的连合-联络纤维投射。CA3区锥体细胞和门区神经元被致痫损伤后,内分子层失神经传入同时苔藓纤维也与靶细胞离断,因而触发苔藓纤维异常发芽回返入内分子层并与该层颗粒细胞树突建立异位突触。MFS的功能意义尚未明了。目前占主导地位的假说是:MFS及突触重构改变了门区及内分子层局部环路,在颗粒细胞间形成异常兴奋性联系,增加了发作敏感性从而促进癫痫的形成[11,15,18～20]。

以上种种假说似乎已将 MFS形成机制以及与癫痫易感性之间的关系做了充分的解释和说明,但有一点似乎被忽略了,那就是 MFS及突触重构的形成必须建立在一个能够被 CNS环境允许的情况下。众所周知,中枢神经系统损伤后难以再生的事实多年来一直是困扰医学界的难题,与之相比,周围神经系统则具有损伤后自我修复的能力。不久前 3种神经轴突再生抑制因子-可溶性髓磷脂相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、少突细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,Omgp)和 Nogo 3种蛋白相继在中枢神经系统被发现。研究显示:Nogo-A及 NgR广泛分布于哺乳动物中枢神经系统内,在海马它们则更是呈现终生高表达的趋势。这一结果似乎与海马在学习和记忆过程中所表现出来的高度可塑性和突触重组是相矛盾的。尤其难以解释癫痫过程中出现的 MFS这种有关苔藓纤维持续出芽生长的现象。

本实验结果显示:NgR蛋白在 KA造模初期表现出一种降量调节的趋势,为以上结果给出了一个可能的解释,即:在 CNS内 Nogo-A持续高表达的情况下,只有 NgR的短期降量调节,才有可能出现海马内突触重组和 MFS的结果。我们建立这一假说基于以下两点:(1)KA导致大鼠癫痫发作的初期,出现了 NgR蛋白的短期降量调节;(2)海马内苔藓纤维在此后的长时间内持续出芽生长。但我们的研究结果发现,NgR蛋白的降量调节是出现在 KA注射后的 2～4h,此后呈现缓慢回升的趋势,至造模第 7天,NgR蛋白水平已恢复到正常。而 MFS最早是在 KA注射后 2w才在齿状回内分子层出现,二者在时间上并不同步。这一现象似乎提示我们,最初导致 NgR受体改变的机制不同于轴突发芽和新突触形成的机制。假如 NgR蛋白短期的降量调节是 MFS的始动因素,那么导致 MF在此后长时间持续出芽生长的机制又是什么呢?在对大鼠 KA模型和癫痫患者的具有内分子层 MF新突触形成的“癫痫性颗粒细胞”的体外生理学研究发现,这些细胞呈多棘波样放电,其放电持续时间长短与 MF密度呈正相关关系。而在对听源性惊厥易感大鼠 P77PMC[1]的研究中我们发现,在经历足够多次的惊厥发作后,可发生海马MF发芽,即单纯惊厥的反复发作就可以导致海马内MF发生突触重组。我们对以上结果作出总结后,提出如下设想:(1)NgR蛋白在 KA造模初期的降量调节,激活了海马齿状回颗粒细胞,导致其轴突出现侧枝发芽;(2)注射 KA后引起大鼠长期反复惊厥发作,对神经元的持续电刺激最终导致 MF长期持续出芽生长。新形成的轴突与原有的胞体和树突间形成了突触联系,导致在齿状回中形成新生的“回返性兴奋性环路”,使海马内兴奋性增高,使癫痫易感性进一步增强,进而导致了癫痫的反复发作和长期维持。

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