慢性酒精中毒性肌病线粒体损伤的实验研究

王剑锋, 齐珊珊, 王永平, 钟丽珍, 张 利, 初海鹰

线粒体是存在于所有真核细胞里的重要细胞器,它除了与能量合成有关外,还具有其他一系列重要的功能,包括产生活性氧[1]、调节细胞氧化还原电势。已有研究表明,在酒精性肝病等疾病中,发现线粒体损伤[2]。在慢性酒精中毒性锰超氧化物岐化酶过表达的转基因小鼠中线粒体发生损伤[3]。而在慢性酒精中毒性肌病中关于线粒体的研究仅见有关ATP合成方面的报道[4],其结构和功能是否发生了其他损伤未见报道。

本实验通过观察慢性酒精中毒性大鼠骨骼肌线粒体膜流动性、膜电位变化及细胞色素 C的表达,探讨慢性酒精中毒性肌损伤过程中线粒体的损伤机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 线粒体提取试剂盒购自凯基生物技术发展有限公司。罗丹明 123试剂购自德国Singma公司。荧光探针 DPH购自德国 Singma公司。小鼠源大鼠细胞色素 C单克隆抗体购自北京中山生物工程有限公司。荧光 FITC-兔抗小鼠 Ig-G购自北京中山生物工程有限公司。SOD、GSH-Px、MDA试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组及取材 健康清洁级雌、雄性 SD大鼠 60只,体重 180～200克(购自大连医科大学实验动物中心)。自由饮食、饮水,置于温度:20℃ ～25℃;湿度:40% ～60%,12h光照、12h黑暗条件下饲养,每 5只为一组分养在笼中。适应性饲养 2w后予以分组。大鼠随机分成两组,实验组(40只),参考文献[5]建立慢性酒精中毒性肌病模型,饲料是在标准全价饲料配方的基础上,每公斤加入玉米油 170ml,鸡蛋 2个,蒸熟后再按比例外加一定量鱼肝油、多维素,混合制成改良的全营养高脂饲料,其中蛋白∶脂肪∶碳水化合物(能量比)=18%∶35%∶11%,其余 36%的总能量实验组由酒精给予,对照组由蔗糖提供。灌胃液为 56°红星牌二锅头(北京酿酒总厂,经辽宁出入境检验检疫局技术中心检测酒精含量为 56.4%),初始用量 4g/kg/d,以后每周增加 2g/kg/d,直至 10g/kg/d。对照组 (20只),给予与酒精体积相等的生理盐水灌胃,两组喂饲相同的高脂饲料。按 Mastaglia[6]等提出的慢性酒精中毒性肌病的组织学诊断标准,判断模型的成功建立。实验第 12周用 10%水合氯醛 1ml/kg以腹腔注射法处死大鼠后进行取材。快速取下麻醉后大鼠的双后肢肌肉,剥离出跖肌。

1.3 线粒体的提取及鉴定 称取 100～200mg肌肉组织,用剪刀剪成碎块放入小容量玻璃匀浆器内,加入 1.5ml冰预冷的 Lysis Buffer,0℃冰浴上下研磨组织。将组织匀浆物转移到离心管,4℃,800g离心 5min。在另一个新的预冷的离心管中预先加入 0.5ml Medium buffer,将匀浆后的上清液 0.5ml(Medium buffer,上清液体积 =1∶1)沿管壁小心地加入该离心管中,覆盖与 Medium buffer的上层。4℃,15000g离心 10min,将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。在线粒体沉淀中加入 0.2ml Wash buffer重悬线粒体沉淀,4℃、15000g离心 10min,弃上清。用 50～100μl Store Buffer的反应缓冲液重悬线粒体沉淀,(50μl/每 100g组织)用于提线粒体蛋白和测线粒体膜流动性。将新鲜提取的线粒体,制成线粒体涂片,取 0.02%詹姆斯绿 B染液数滴滴于载玻片上,盖上载玻片。10min后用油镜观察,可以观察到线粒体被染成蓝绿色,呈条状或颗粒状。

1.4 线粒体膜流动性的测定 DPH配成2mmol/L溶液,贮于 0℃。实验时取出 DPH,将 2ml线粒体膜蛋白加入 2ml DPH中,37℃标记 30min,离心弃去上清,将沉淀悬起后立即测定荧光强度 IHV、IVH、IVV、IHH、荧光激发波长 362nm,发射波长432nm,按公式 G=IHV/IHH,P=(IVV-GIVH)/(IVV+GIVH),η=2P/(0.46-P),计算出荧光偏振度(P),微粘度(η)。

1.5 线粒体膜电位的检测 用机械分离的方法将跖肌剪成肉糜状,PBS冲洗,用 60目细胞筛过滤,800转 /分,离心 5min,弃上清,留少量液体将沉淀吹打均匀,用 200目细胞筛过滤,800转 /分,离心5min,弃上清,留少量液体将沉淀吹打均匀,得到单个细胞悬液,细胞计数,取 1×106细胞加入 1ml罗丹明 123(5μg/ml),轻轻吹打,置于 37℃孵育40min,用 PBS(缓冲液预热至 37℃)洗涤 3次后,300μl PBS重悬细胞,收集 104个细胞,最大吸收波长 590nm,激发波长 488nm,用流式细胞仪 Cell Quest程序重复测量 3次。

1.6 分光光度法检测 SOD、GSH-Px、MDA处死大鼠后快速取其跖肌,用冰生理盐水清洗后准确称重,用预冷的匀浆介质(pH7.5,0125mol/L蔗糖,0.025mol/L Tris-HCl,0.0001mol/L EDTA)分别制成 10%的肌组织匀浆。具体操作如下:用含 1nmol EDTA的冰生理盐水冲洗肌肉以去除红细胞。将肌组织切碎,置于冰生理盐水中混匀。混匀液离心(8500g 4℃)10min取上清液。参照试剂盒所述方法,用分光光度计法分别检测 SOD、GSH-Px、MDA。(所有结果均以每克肌组织的含量表示)。

1.7 Western Blot检测细胞色素 C表达 取线粒体蛋白 80μg加入制备好的 15%SDS-PAGE凝胶上行垂直电泳分离,硝酸纤维素膜电泳转移印迹,3%BSA封闭膜 40min,加入鼠抗细胞色素 C单克隆抗体(1∶200稀释),4℃过夜,PBST洗膜 3次,每次10min,加入兔抗鼠 IgG抗体(1∶2000稀释),37℃孵育 40min,再经 PBST洗膜 3次,每次 10min,PBS洗膜 5min,经 ECL显色。为检测蛋白裂解/转移的变化,所有的印迹分别采用丽春红(抗体孵育前)和考马斯亮蓝(化学发光法检测后)染色。所有图片采用凝胶成像分析系统(UVP,美国)进行分析,GAPDH为内参照,目的蛋白与 GAPDH光密度比值为目的蛋白的相对值。

1.8 统计学处理 实验结果应用 SPSS13.0软件进行数据分析与作图。计量资料均用±s表示,显著性差异用 t检验,P﹤ 0.05具有统计学意义。

2 结 果

2.1 生化测定结果 实验组大鼠骨骼肌(跖肌)中 MDA含量高于对照组(P﹤ 0.001)。实验组大鼠骨骼肌(跖肌)中 SOD显著低于对照组(P﹤0.05)。实验组大鼠骨骼肌(跖肌)中 GSH-Px活性显著低于对照组(P﹤ 0.05)(见表1)。

2.2 线粒体膜电位改变 对照组大鼠骨骼肌(跖肌)中罗丹明 123的荧光强度为 11.433±1.060,实验组为 2.933±5.860。实验组较对照组明显降低(P﹤ 0.001)(见图1)。

2.3 线粒体膜流动性改变 对照组大鼠骨骼肌(跖肌)线粒体膜微粘度为 1.817±0.643,实验组为 3.681±0.744,实验组较对照组微粘度(η)明显增高(P﹤ 0.001)。

2.4 细胞色素 C的表达变化 实验组大鼠骨骼肌(跖肌)线粒体膜上细胞色素 C的表达较对照组减少 (见图2)。

表1 各组大鼠的 SOD、GSH-Px、MDA测定结果 ±s)

表1 各组大鼠的 SOD、GSH-Px、MDA测定结果 ±s)

对照组实验组P 10100.713±0.0281.325±0.226﹤0.01148.187±5.82298.897±8.840﹤0.0586.447±7.00470.912±4.898﹤0.05

图1 线粒体膜电位流式细胞仪检测结果

图2 细胞色素 C在大鼠骨骼肌的表达

3 讨 论

慢性酒精中毒性肌病(Chronic alcoholic myopathy,CAM)是嗜酒者中常见的一种疾病。已有研究表明,在慢性酒精中毒性肌病中骨骼肌内的线粒体出现堆积,线粒体肿胀、嵴消失,膜局部溶解,形状变得不规则[7]。肌细胞线粒体结构和功能均受到损害,线粒体数目减少、线粒体氧化还原能力下降和能量产生降低[8]。Mansouri[9]等亦发现急性酒精中毒会引起肌肉中线粒体的损伤以及 DNA的缺失,减少机体抗氧化能力。

本研究通过建立大鼠慢性酒精中毒性肌病模型,测定慢性酒精中毒性大鼠骨骼肌组织氧化抗氧化指标,实验结果显示:以Ⅱ型肌纤维为主的跖肌中SOD和 GSH-Px的水平较对照组显著的降低(P＜0.05);MDA值则较对照组有明显升高(P＜0.001)。

已有研究表明,CAM的发生与氧化应激有关[10,11]。在 CAM中细胞内抗氧化剂 SOD,GSH-Px以及脂质过氧化物 MDA出现明显的变化,可以间接反映出大鼠慢性酒精中毒性肌病模型骨骼肌中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高。也就是说它们活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力,其活性的降低可以间接反映 ROS的增多。线粒体是 ROS产生的主要场所,又是 ROS作用最敏感的部位。ROS的多少可以反映出体内氧化应激的状态。当体内 ROS生成与抗氧化状态失衡时,机体便发生了氧化应激。丙二醛(MDA)是自由基反应产生的主要降解产物,MDA可引发机体脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化产物,故 MDA的量可反应机体内脂质过氧化的程度,间接反映细胞氧化应激的程度。长期过量饮酒,机体产生大量氧自由基,抗氧化剂、抗氧化酶被大量消耗用于清除氧自由基,致使氧化与抗氧化失衡,机体抗氧化防御系统受到破坏,机体受到损伤。

线粒体膜流动性的大小是生物膜的一个参数,正常线粒体必须维持一定的膜流动性。本研究表明实验组线粒体细胞膜微粘度较正常组升高,显示出线粒体膜流动性下降。线粒体的膜流动性主要是由心肌磷脂所赋予的。已知 ROS可以诱导线粒体心磷脂(Cardiolipin)氧化损伤[12]。我们推测,在 CAM中,由于骨骼肌内氧化抗氧状态失衡,ROS增多,心磷脂接近线粒体 ROS产生的部位,由于心磷脂不饱和酰基链的特性,CAM中的心磷脂极容易受到 ROS的氧化攻击。并且线粒体含有丰富的心磷脂和较少的胆固醇,这样的组成使线粒体内膜上的心磷脂更易受到 ROS的氧化,心磷脂不饱和脂肪酰基链与线粒体功能的最佳发挥相适应,被氧化的心磷脂改变原有结构,线粒体膜流动性改变。

细胞色素 C是线粒体膜上的一种重要的蛋白质,它结合在心磷脂上。本研究显示实验组线粒体中的细胞色素 C较对照组减少,推测与 ROS的增多有关。由于心磷脂不饱和酰基链的特性。心磷脂的过氧化作用导致细胞色素 C从线粒体内膜解离。CAM模型中骨骼肌里增多的 ROS使线粒体内膜上的心肌磷脂氧化,被氧化的心肌磷脂,结构发生改变,不能维持原有的功能,不能再与细胞色素 C结合。细胞色素 C在抗氧化系统中起着极其重要的作用。细胞色素 C的电子漏可以部分清除 O2-·和H2O2,而且氧化型的细胞色素 C可以直接将 O2-·氧化为 H2O。另外细胞色素 C从线粒体释放到胞浆是线粒体介导的细胞凋亡极其重要的早期事件[13]。因此,我们观察到的实验组线粒体中的细胞色素 C较对照组减少,一方面表明在 CAM中线粒体发生了一定的变化,细胞色素 C从线粒体膜上释放,细胞色素 C的减少增加了 CAM中 O2-·的生成,加重了骨骼肌的损伤。另外,在 CAM中细胞色素 C的这种减少是否是凋亡的信号,还有待于进一步研究。

跨膜电位的存在使一些正电荷荧光染料如罗丹明 123、DiOC6(3)、JC21、CMX2ROS可结合到线粒体基质。本实验应用罗丹明 123来检测线粒体跨膜电位正是根据这个原理。在线粒体内膜跨膜电位△Ψm降低的情况下,罗丹明 123在线粒体内的滞留减少,检测到的荧光强度也就减少。本实验检测到实验组大鼠骨骼肌(跖肌)中罗丹明 123的荧光强度较对照组明显降低(P﹤ 0.001)。在 CAM中,由于SOD和 GSH-Px活性下降,ROS在线粒体内膜内侧不能被清除,使骨骼肌细胞发生氧化应激。伴随着氧化应激的发生,脂质发生过氧化作用损伤线粒体膜,引起线粒体 PTP的开放,继而使线粒体跨膜电位△Ψm下降。线粒体跨膜电位△Ψm是线粒体主要功能指标之一。由于 CAM中△Ψm下降,这可能使电子在呼吸链内传递时间延长,电子与 O2接触时间延长,生成的 O2-·就会增多,继而引起更大的损伤。

综上所述,通过研究 CAM中线粒体膜流动性,线粒体膜上细胞色素 C的表达及线粒体跨膜电位的变化,揭示了慢性酒精中毒性肌病与线粒体损伤密切相关,为进一步探讨慢性酒精中毒性肌病中线粒体损伤机制提供了理论依据。

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