宁夏汉族人126名甘露糖结合凝集素基因多态性分析*

马力通 ,李 珺,王玉炯

(1.内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,包头 014010;2.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,银川 750021)

甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)是参加天然免疫的宿主防御分子,它能够通过凝集素途径激活补体系统和吞噬作用从而在宿主免疫防御中发挥重要作用[1]。迄今为止,所发现的MBL基因结构区突变均为第1外显子的点突变,分别是密码子 54(GGC→GAC,Gly→Asp)、57(GGA→GAA,Gly→Glu)以及密码子 52(CGT→TGT,Arg→Cys)(简称为MBL-54、MBL-57和MBL-52,相应突变的等位基因命名为B、C、D,野生型为 A),这些基因的突变干扰了M BL形成稳定的功能性的多聚体,使血清中MBL水平下降,从而导致了调理缺陷,这与临床反复感染、系统性红斑狼疮、艾滋病以及乙型肝炎等多种疾病的发生相关。在MBL研究的基础上,临床治疗中研究者成功尝试输入天然血浆MBL或输入重组M BL来改善由MBL缺失引起的慢性疾病的状况[2]。MBL基因点突变存在种族差异。目前,尚无宁夏汉族人群MBL基因突变类型及其频率研究的报道。为此研究中国宁夏汉族人群的MBL基因突变,为进一步了解MBL基因突变与疾病的关系提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 126名无血缘关系的健康个体均来自于宁夏地区,其中男84名,女42名,年龄 6～69岁,其父母均为宁夏汉族。在知情同意的原则下,抽取研究个体的外周静脉血待用。

1.2 MBL基因的扩增 参照文献[3]提取外周血基因组DNA,以所提取基因组DNA作为模板扩增MBL基因外显子1,参照文献[4]设计引物,引物由华美生物公司合成。引物序列为(1)M BL54和 MBL57的 PCR引物序列,Forward:5′-AGT CGA CCC AGA TTG TAG GAC AGA G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG-3′。(2)MBL52的 PCR引物序列,Forward:5′-CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA AGA CGC G-3′,Reverse:5′-AGG ATC CAG GCA GT T TCC TCT GGA AGG-3′。PCR反应体系为20μ L:基因组 DNA 1.5 μ L,10 ×PCR Buffer 2 μ L,2 μ M 引物各 2 μ L,2.5 mM dNTPs 1.6 μ L,5 u/mL Taq DNA 聚合 酶 0.2 μ L,10.7 μ L ddH2O。PCR反应条件为(1)MBL54和 MBL57的反应条件:94℃4 min;94℃30 s,58℃40 s,72℃60 s,35个循环;最后72℃5 min。(2)MBL52的反应条件:在密码子52位处利用SDM-PCR引入一个新的酶切位点 MluⅠ,其PCR反应条件为94℃4 min;94℃40 s,65℃40 s,72℃60 s,28个循环;最后72℃5 min。PCR扩增产物20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下观察结果。

1.3 限制性内切酶酶切 酶切反应体系15 μ L PCR扩增产物 1.5 μ L,Buffer 2 μ L,BSA 0.2 μ L,限 制性内切酶 0.2 μ L,ddH2O 11.1 μ L。PCR 扩增产物分别被 BanⅠ 、MboⅡ 、M luⅠ于50℃、37℃、37℃酶切4～5 h。酶切产物经80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电泳结束后常规银染,凝胶成像仪观察结果并拍照。

1.4 统计学方法 计算出宁夏汉族MBL基因的各种基因型频率和等位基因频率,使用SPSS12.0软件包进行数据统计处理,利用χ2检验分析MBL基因多态性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及各组间差异,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MBL基因多态性PCR-RFLP结果 见图1。

图1 MBL基因多态性PCR-RFLP结果

2.2 宁夏汉族MBL基因多态性分布情况 在宁夏汉族只检测出两种等位基因野生型A和变异型B(54位密码子由GGC→GAC)未检出变异型C、D等位基因。126名共检出野生型AA为90名,突变杂合型AB为35名,突变纯合型BB为1名;基因型频率分别为0.714 3,0.277 8,0.007 9;A,B基因频率分别为0.853 2,0.146 8。经χ2检验,符合 Hardy-Weinberg平衡定律,说明本研究人群具有群体代表性。

2.3 与其他汉族人群M BL基因多态性分布的比较 宁夏汉族与广东汉族[5]均只检出 A、B两种等位基因,经χ2检验,宁夏汉族与广东汉族[5]之间MBL基因多态性分布差异有统计学意义(P＜0.05,表1)。并且前者B的等位基因频率明显高于后者。

表1 宁夏、广东两地汉族MBL基因多态性分布情况

3 讨 论

MBL是第1个被发现的具有防御功能的C型凝集素。编码MBL的基因含有4个外显子,分别编码N-端富含半胱氨酸区、胶原样区、颈区和糖识别区。其中外显子1编码N-端富含半胱氨酸区和部分胶原区。MBL结构基因外显子1第52、54、57位的突变使其产物不能形成稳定的功能性的多聚体结构,从而造成MBL不能发挥调理作用和激活补体凝集素途径的作用。

人群中MBL的基因突变率很高,并且MBL结构基因各点突变的基因频率与种族有关。南部非洲人以57位密码突变多见。MBL-54突变主要发生在欧洲、亚洲人群中,而在黑人中MBL-54突变极罕见。MBL-52突变少见且种族差别不明显。国外近年来已在几个种族人群中研究MBL基因多态性与感染性疾病、自身免疫性疾病的相关性[6]。国内对汉、维、蒙、藏、彝族的研究中未发现MBL-52、MBL-57的基因突变,但是MBL-54的基因突变却很常见[7]。本文所取样本为一般人群,除了要求为汉族外,未作任何限制,故可以代表宁夏地区的汉族人群。

本实验确定了宁夏汉族人群MBL基因多态性位点等位基因的分布情况,研究结果显示,宁夏汉族人群与文献[5]中的广东地区汉族相比较,M BL基因多态性分布差异显著,并且宁夏汉族人群B的等位基因频率明显高于后者。汉族是中华民族的主要成员。汉族的形成和发展,经历了一个十分复杂的融合、迁移的历史过程,是历史上融合了许多古代的非汉族人群而形成的。杜若甫和肖春杰[8-9]认为以长江为界,中国汉族人群分南、北两大类型。各地汉族与当地的少数民族在遗传结构上十分相近,而南、北方汉族的遗传结构却相差甚远,接近于南、北方少数民族间的平均差异。宁夏汉族MBL基因多态性分布与广东汉族[5]相比有明显差异,证实了同一人种内部MBL各等位基因分布存在地理差异也进一步支持中国汉族人群可分为南北两类的假设。同时本研究对宁夏汉族MBL基因多态性获得的数据为进一步研究MBL基因突变与疾病间的关系提供数据支持。

[1] Eveline CA,Andy IH,Jelle S,et al.Mannose binding lectin plays a crucial role in innate immunity against yeast by enhanced complement activation and enhanced uptake of polymorphonuclear cells[J].BMC Microbiol,2008,18:229.

[2] Takahashi K,Shi L,Gowda LD,et al.Relative roles of complement factor 3 and mannose-binding lectin in host defense against infection[J].Infect Immun,2005,73(12):8188.

[3] 黄霞,毛伟,王蓉感,等.用PCR-SSP方法研究重庆地区人群HLA-DRB1基因多态性[J].重庆医学,2005,34(2):242.

[4] Malik S,Arias M,Di Flumeri C,et al.Absence of association between mannose binding lectin gene polymorphisms and HIV-ⅠColombian population[J].Immunogenetics,2003,55(1):49.

[5] 王方勇,陈政良,吕成伟,等.广东地区汉族人M BL基因GGC54GAC点突变的初步筛查[J].免疫学杂志,2002,18(B06):1.

[6] Peter G,Flemming L,Hans OM,et al.Mannose-binding lectin deficiency-revisited[J].Mol Immunol,2003,40(2-4):73.

[7] 施红,王福生,金磊,等.中国五个民族的甘露糖结合蛋白基因多态性特点及意义[J].中华医学遗传学杂志,2001,18(3):202.

[8] 杜若甫,肖春杰.从遗传学探讨中华民族的源与流[J].中国社会科学,1997,4:139.

[9] 肖春杰,杜若甫,Cavalli-Sforza LL.中国人群基因频率的主成分分析[J].中国科学(C辑),2000,30(4):434.