补阳还五汤家兔含药血清对家兔血小板PAF受体活性的影响

张继平，宫 丽，李齐欢，姚 晖，文凤妮，李蜀光，林爱华，王志彬

(佛山市第二人民医院，广东佛山 528000)

补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》，由生黄芪 120g，归尾 6g，赤芍 4.5g，川芎、桃仁、红花、地龙各3g组成，该方以其补气、活血、通络之功一直用于临床，疗效显著，是目前治疗中风等血栓性疾病的经典名方。我们前期研究发现，补阳还五汤多次体内给药有提高家兔血小板活化因子(Platelet-activating Factor，PAF)受体与［3H］-PAF 放射配基特异结合量和特异结合率的趋势，其作用与PAF特异性受体阻滞剂银杏叶提取物无显著差异;补阳还五汤注射液体外给药有抑制家兔洗涤血小板PAF受体与放射配基的特异结合的作用。1988年日本学者田代真一正式提出“中药血清药理学”概念，中药血清药理学方法可在某种程度上克服中药本身的理化因素对实验结果的干扰，在中药复方的药理研究中具有极强的针对性。目前，已见神经细胞或内皮细胞保护方面的补阳还五汤血清药理学研究报道，但该方在抑制血栓的作用机理方面的血清药理学研究尚未见报道。本文在前期研究的基础上，结合血清药理学和放射配基受体结合法，研究补阳还五汤家兔含药血清对家兔血小板PAF受体活性的影响，以进一步阐明该方防治血栓性疾病的药理作用机制。

1 材料

1.1 动物

新西兰白色家兔，体重2.0kg～3.0kg，实验动物和动物实验设施由广州中医药大学实验动物中心提供［动物合格证号粤监证字2006A006 SYXK(粤)2003-0001，动物环境设施合格证号SYXK(粤)2003-0001］。

1.2 药物

饮片于佛山市康普医药公司和健民医药公司购得，按文献方法制备补阳还五汤水煎液(含生药量分别为1.16g生药/ml、2.9g生药/ml)和不含黄芪的补阳还五汤水煎液(组方为赤芍4.5g，归尾6g，川芎、桃仁、红花和地龙均为3g，含生药量为2.9g生药/ml)。将金纳多片(批号8281005)研成细末，用蒸馏水配制成4.84mg/ml(按照家兔体表面积换算的临床等效剂量的5倍)水溶液。

1.3 试剂

放射性同位素:［3H］-PAF(Amersham 公司，包装量 250Ci，比活值 175Ci/mmol，批号 200402)，PAF标准品 5mg(L-105，PAF-18，Biomol公司，批号P1318V)，小牛血清白蛋白(BSA，MBChem分装，批号20041108)，三羟甲基甲烷(Tris，进口分装，批号20030518)，2.5-苯基恶唑(PPO)及二甲基-POPO(Fluka Chemie瑞士，批号290981889)，其他试剂均为国产分析纯。

1.4 仪器

LS-5810 型液闪仪(Beckman，美国)，ZT-Ⅱ型多头细胞分离器(浙江绍兴卫星机械公司)，KDC-2046低速冷冻离心机(安徽科大创新股份公司中佳分公司)，WMZK-08型电热恒温干燥箱(广州东方红医疗器械厂)，YKH-Ⅱ型液体快速振荡器(广东汕头广播仪器厂)，微量加样器、超低温生物冰箱(日本SANYO公司)，其他冰箱(国产)、水浴箱、一次性注射器、试管等。

2 方法

2.1 含药血清的制备

2.1.1 动物分组 新西兰家兔30只，雌雄各半，根据体重用随机数字表法随机分为补阳还五汤水煎液低剂量组(A组)、补阳还五汤水煎液高剂量组(B组)、不含黄芪的补阳还五汤水煎液组(C组)、金纳多组(D组)、蒸馏水组(E组)5组。

2.1.2 含药血清的制备 A组:用1.16g生药/ml补阳还五汤水煎液10ml/kg灌胃;B组:用2.90g生药/ml补阳还五汤水煎液10ml/kg灌胃;C组:用2.90g生药/ml不含黄芪的补阳还五汤水煎液10ml/kg灌胃;D组:用4.84mg/ml金纳多水溶液10ml/kg灌胃;E组:用等体积蒸馏水10ml/kg灌胃。每天1次，连续灌服5d，每组灌胃的药物体积相同。有文献报道，在96个药物口服后达峰时间中，药物口服给药后1h～2h内达峰的占药物总数的91.66%，故在末次给药前禁食12h，给药结束2h后家兔清醒状态下取耳中央动脉血10ml，室温静置2h后离心(4℃ 2500r/min 10min)分离后的家兔血清于56℃水浴中30min灭活，分装，－40℃冰箱冻存备用。

2.2 ［3H］-PAF与洗涤血小板PAF受体结合测定

2.2.1 家兔洗涤血小板悬液的制备 正常家兔清醒状态下颈总动脉插管取血40ml，用3.8%枸橼酸三钠抗凝(血:抗凝剂，9∶1)混匀后塑料试管分装，在4℃ 1000r/min(离心力200×g)离心10min，取上层富含血小板血浆加等体积的磷酸缓冲液(KH2PO40.22g，Na2HPO40.86g，柠檬酸 0.86g，葡萄糖0.44g，溶于500ml蒸馏水中，pH 6.5)混匀，在4℃ 2900r/min(离心力1682g)离心10min，取沉淀用等体积的磷酸缓冲液混匀，4℃ 3000r/min(离心力1800g)离心5min后弃上清，取血小板沉淀，重复洗涤1次;取沉淀的血小板加入含有0.1%BSA和1mmol/L的MgCl2磷酸缓冲液中，稀释成(2.5～6)×107/ml的血小板悬浮液(PRP)备用。

2.2.2 放射配基受体结合实验 总结合管(T):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L，浓度为终浓度，下同)+蒸馏水5μl;非特异结合管(P):取 PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+冷PAF 5μl(1μmol/L);样品管(Y):取PRP 380μl+［3H］-PAF 10μl(0.35nmol/L)+含药血清 5μl;以上每管平行作三管，取均值计算之。加样完毕后，在振荡器上混合振摇30s，然后在25℃温浴40min，用含有0.1%BSA的冰冷Tris缓冲液终止反应，用多头细胞分离器真空抽滤，过滤分离游离与结合的［3H］-PAF，滤纸用冰冷的Tris缓冲液洗4次，滤纸片放入红外线烘箱内(80℃，1h)烘干，置2ml已测本底的二甲苯闪烁液中，在液闪仪中测定放射性。计算特异结合率=［(T－P)/T］×100%和特异结合抑制率=［(T－Y)/(T－P)］×100%。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 补阳还五汤家兔含药血清对［3H］-PAF与家兔血小板PAF受体结合的影响

表1显示，补阳还五汤含药血清能明显抑制［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体的特异结合，其抑制作用明显强于蒸馏水组(P﹤0.01)，弱于金纳多组(P﹤0.01);补阳还五汤高、低剂量组和不含黄芪的补阳还五汤组对［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体特异结合的抑制率作用依次为不含黄芪的补阳还五汤组>补阳还五汤低剂量组>补阳还五汤高剂量组，但统计学比较无显著性差异(P>0.05)。

表1 补阳还五汤含药血清对［3H］-PAF与家兔血小板PAF受体结合的影响(±s)

表1 补阳还五汤含药血清对［3H］-PAF与家兔血小板PAF受体结合的影响(±s)

注:同蒸馏水组比较:**P<0.01;同金纳多组比较:△△P<0.01

组别 n 特异结合率(%)特异结合抑制率(%)补 阳 还 五 汤 低 剂 量 组 6 27.70±3.00**△△ 57.5± 6.23**△△补 阳 还 五 汤 高 剂 量 组 6 34.5 ±5.74**△△ 47.5 ±14.06**△△不 含 黄 芪 补 阳 还 五 汤 组 6 23.5 ±6.77**△△ 63.9 ±11.92**△△金 纳 多 组 6 13.4±4.94** 84.2±12.33**蒸 馏 水 组 6 40.5±5.94△△ 27.9±10.27△△

4 讨论

PAF来源相当广泛，体内血小板、中性粒细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、神经元、心肌细胞等多种细胞受到刺激后均能产生并释放PAF。PAF具有广泛的生物学作用，如强烈激活血小板作用、促进中性粒细胞聚集、增加血管通透性等。PAF的多种生物学效应要通过与其受体的特异性结合来实现。PAF受体是一种G蛋白偶联受体，用3H-PAF或PAF拮抗剂3H-WEB2086进行配体结合实验，证明在人和动物许多组织和细胞表面都存在有PAF受体，其中血小板是PAF受体含量最多的组织之一。PAF是迄今发现体内作用最强的血小板聚集剂，其特有的磷脂结构与血小板膜受体结构结合后，通过激活膜磷脂代谢及激发钙离子进入血小板使血小板聚集。PAF诱导的血小板聚集过程，不依赖于二磷酸腺苷(ADP)或花生四烯酸(AA)的代谢产物血栓素A2(TXA2)，故不被ADP清除和氧化酶抑制剂所阻断，因而被认为是诱导血小板聚集的第3条途径。

许多严重危害人类健康疾病的发生发展与血栓形成密切相关。血管内皮损伤、血小板功能亢进、血液凝固性增高、纤溶活性降低、血液黏滞性增大、血流动力与流态条件变差等都是血栓形成的重要原因。血小板参与了血栓形成的整个过程，血小板的激活是血栓形成过程中很重要的始动因素。血管内皮细胞受到刺激(如凝血酶、缓激肽和组胺等)可合成和释放PAF，PAF一方面通过激活血小板促进凝血酶和纤维蛋白生成，另一方面通过激活中性粒细胞造成血管内皮受损。PAF与血管内皮细胞、血小板等相互作用，在血栓形成过程中起着重要作用。近年临床研究表明，中风患者服用抑制TXA2生成的药物，可以改善缺血性脑血管病的症状，该药物通过抑制血小板环氧化酶代谢而阻止血栓形成，但不能阻断由于PAF引起的血小板的继续活化，此乃中风难治的重要原因之一。基于这一原因，在中风治疗时除考虑抑制TXA2、凝血酶、胶原等诱导血小板聚集的途径外，抑制PAF诱导的血小板聚集对防止病理性血栓形成尤为重要。

补阳还五汤临床应用广泛，疗效显著，是目前中风等血栓性疾病治疗应用频率最高的方剂。中药血清药理学方法可在某种程度上克服中药本身的理化因素对实验结果的干扰，在中药复方的药理研究中具有极强的针对性。我们前期研究表明，补阳还五汤注射液体外给药能明显抑制家兔洗涤血小板PAF受体与放射配基的特异性结合，其特异结合抑制率与银杏苦内脂B相似，但高浓度反而抑制作用减弱;补阳还五汤体内多次灌服给药，能提高家兔洗涤血小板PAF受体与放射配基的特异结合量，其作用与银杏叶提取物相似并高于空白组。本文研究发现，含补阳还五汤药物血清能明显增强抑制［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体的特异结合，提示补阳还五汤含药血清中某些活性成分有直接抑制［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体特异结合的作用。同时，结合补阳还五汤注射液对PAF受体与放射配基的特异结合有双向调节作用，以及从不含黄芪的补阳还五汤注射液对［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体特异结合的抑制作用明显强于补阳还五汤注射液来分析，补阳还五汤组方中的黄芪对该方抑制家兔血小板PAF受体活性作用有缓和作用，体现了补阳还五汤中配伍大剂量生黄芪以求“大补元气，气旺以促血行，祛瘀而不伤正”的配伍机制，这与本课题组前期对补阳还五汤拆方研究发现生黄芪在补阳还五汤中可降低活血药对PAF受体结合作用的过强抑制，使整方抑制［3H］-PAF与兔血小板受体结合的作用缓和结果一致。而补阳还五汤含药血清对［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体特异结合的抑制作用弱于金纳多药物血清，这与金纳多是银杏叶提取物，其中的萜类成分为血小板PAF受体的特异拮抗作用有关。

补阳还五汤含药血清可以明显抑制［3H］-PAF与家兔洗涤血小板PAF受体的特异结合而达到抑制血栓形成的目的，但究竟含药血清中哪种活性成分起关键作用，或是多种活性成分间的协同作用，尚待进一步研究。