银杏达莫在内皮细胞氧化损伤中保护作用的实验研究

崔 磊 矫春晓 李敬田 黄奇迅*

银杏达莫（Geinkgo Leaf Extract and Dipyridamole Injection，GLED）是银杏黄酮（Geinkgo Leaf Extract）、双嘧达莫（Dipyridamole）等的复方制剂，具有扩张心脑血管、抑制血小板聚集及释放等功能，在临床上被广泛应用于各种缺血缺氧性疾病。但其具体作用机制至今仍未完全明确。本实验以H2O2造成动脉内皮细胞损伤模型，进行原代培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）及家兔血管内皮损伤试验，观察银杏达莫在内皮细胞氧化损伤中的保护作用，初步探讨其作用机制，为银杏达莫更好的应用于临床各种缺血性疾病提供一定的理论基础[1-3]。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

银杏达莫注射液（贵州益佰制药股份有限公司），实验前用完全培养液按递倍稀释法稀释至所需浓度。MTT、胰蛋白酶（Sigma公司）；胎牛血清（上海劲马生物科技有限公司）；微量MDA试剂盒，SOD试剂盒（南京建成公司）；PRMI1640培养基（潍坊医学院生物化学与分子生物学实验室）；H2O2（30%）；青霉素，链霉素（鲁抗医药）等均为国产分析纯。

1.2 实验组织及动物选择

足月新生儿脐带（烟台经济技术开发区医院产科）；家兔（潍坊医学院动物实验中心）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

①正常对照组；②H2O2（终浓度150μmol/L）损伤组；③GLED干预组（400、200、100、50μmol/L）。

1.3.2 人脐静脉内皮细胞培养

取足月新生儿脐带（20～30cm，4h内），采用王皓等[4]方法（培养基为PRMI1640培养基）进行内皮细胞的原代培养及传代培养。

1.3.3 银杏达莫在HUVECs氧化损伤中的保护作用

HUVECs传2～3代后取对数生长期细胞制备细胞悬液，培养板接种，37℃，5%CO2孵育24h后，按实验分组随机分10组：损伤组及干预组加入终浓度为150μmol/L H2O2进行损伤0.5h后，正常组及损伤组加入含20%FCS的RPMI-1640培养基；干预组分别加入各浓度银杏达莫。培养4h后，收集细胞或培养液进行有关实验。

1.3.4 MTT比色法测定HUVECs增殖率

细胞接种于培养板相关培养后，加入MTT（终浓度0.5mg/L），37℃，5%CO2培养箱孵育4h后，2500转/min、4℃ 10min离心后吸弃上清液，加入二甲基亚砜100μL/孔，10min后于酶标仪上测570 nm处吸光度值（OD570）。计算细胞损伤增殖率，并依次应用OriginPro 软件分析EC50。

2.2 银杏达莫对动物动脉内皮氧化损伤的保护作用

2.2.1 动物实验模型[5-9]

氧化损伤模型：参照实验家兔血容量由耳缘静脉注射H2O2（终浓度达150umol/L）；损伤保护模型：氧化损伤半小时后参照家兔血容量由耳缘静脉注射银杏达莫（终浓度达400μmol/L）。

2.2.2 实验动物分组

随即所选15只家兔分为3组，每组各5只，统一饲料、饮水室温饲养1周后分组。①正常对照组：不予以任何处理，继续以相同饲料、饮水室温饲养。②氧化损伤组。③ GLED保护组，处理参照动物实验模型方法。每周日处理一次，统一饲料、饮水室温饲养，连续4周后取家兔腹主动脉HE染色，镜下观察动脉内皮结构。

2.1.3 银杏达莫对家兔动脉氧化损伤的保护作用

腹腔麻醉家兔（戊巴比妥钠30mg/kg体质量），快速剪开腹正中皮肤及肌肉，分离腹主动脉，洗净处理后常规石蜡包埋、切片（4μm厚），常规H-E染色。

表1 银杏达莫在HUVECs氧化损伤中的保护增殖率

3 实验结果

3.1 MTT比色法测定细胞的增殖率

对H2O2造成的HUVECs氧化损伤银杏达莫有显著的保护作用，可提高损伤细胞的增殖率，见表1及图1。

图1 内皮细胞氧化损伤保护率

3.2 H-E染色观察银杏达莫在家兔动脉内皮氧化损伤中的保护作用

实验结果显示，较高浓度银杏达莫对H2O2造成的动脉内皮损伤有比较显著的保护作用。H-E染色结果分别为：①正常对照组腹主动脉壁层次清晰，内膜薄，中层平滑肌层无萎缩、厚度均匀，外层为疏松结缔组织，见图2-1。②损伤模型组腹主动脉壁层次欠清，可见内皮细胞脱落，内膜下炎细胞浸润。中层平滑肌层明显萎缩，外层为疏松结缔组织缺如或稀少，见图2-2。③ GLED保护组动脉各层与正常对照无明显区别，未见炎细胞，分别见图2-3、图2-4。

4 讨 论

H2O2产生的自由基（·OH）在机体内性质极为活泼，具有强烈的脂质过氧化作用，病理状态下，过氧化物产生过多或抗氧化酶类活性降低，则可引发链式脂质过氧化，损伤细胞多种成分（膜磷脂、蛋白、核酸），以致使细胞死亡。本研究以H2O2诱导HUVECs细胞进入氧化应激状态，可以发现内皮细胞氧化损伤后，细胞病死率升高，增值率下降，细胞清除自由基的能力下降；

图2 H-E染色观察银杏达莫在家兔动脉内皮氧化损伤中的保护作用

自由基造成血管内皮细胞的损伤是多种缺血性疾病发生进展的关键因子，内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化的第一步和决定性因素。所以，清除自由基减少内皮损伤被认为是防治动脉粥样硬化的必要途径[10,11]。

实验中各浓度的银杏达莫，对H2O2造成的内皮细胞损伤均能起到一定的保护作用，并且有一定的浓度依赖性。说明银杏达莫在缺血性疾病的防治中的作用可能与清除自由基有关，其具体机制还需进一步实验研究。

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