卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测及其临床意义

温 岩,孙晓艳,何 津,于晓伟*

(吉林大学第一医院 1 .妇产科;2.放射科,吉林 长 春 130021)

卵巢癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测及其临床意义

温 岩1,孙晓艳2,何 津1,于晓伟1*

(吉林大学第一医院 1 .妇产科;2.放射科,吉林 长 春 130021)

目的探讨卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞的比例变化及其可能的机制。方法利用流式细胞仪检测20例卵巢癌患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)及肿瘤相关淋巴细胞(tumor associated lymphocytes,TALs)中CD4+CD25+调节性 T细胞(CD4+CD25+T cells,Tregs)所占的比例。10例健康人外周血PBLs中Tregs所占的比例。同时检测卵巢癌患者CD4+外周血淋巴细胞中CD69+细胞的比例。健康人PBLs在含有卵巢癌细胞株SKOV3培养上清的RPMI1640培养液(有或没有血清植物血凝素)中培养72小时后,检测Tregs所占的比例。结果卵巢癌患者外周血淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞所占比例与健康人相比明显增加.卵巢癌患者外周血肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞所占比例高于在外周血淋巴细胞和肿瘤相关淋巴细胞中的比例,但是没有统计学意义。卵巢癌患者CD4+外周血淋巴细胞中无CD69表达。结论卵巢癌患者外周血淋巴细胞中、肿瘤浸润淋巴细胞及肿瘤相关淋巴细胞中CD4+CD25+调节性T细胞所占的比例增加,这可能与卵巢癌细胞分泌的可溶性分子上调有关。

卵巢癌;免疫抑制;调节性T细胞

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1402)

卵巢癌的致死率占各类妇科肿瘤的首位,5年生存率仅为25%-30%,严重威胁着女性的生命健康。随着免疫学和基因工程技术的迅速发展,免疫治疗已被认为是提高卵巢癌患者存活率的一种治疗选择,进而关于卵巢癌细胞免疫的研究就引起了研究者的关注。肿瘤局部免疫微环境中,可见到肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)或其它免疫细胞,但免疫细胞的数量、表型和功能却与正常人组织中的免疫细胞有着巨大差别,其中Tregs在肿瘤免疫中尤为引人关注,是影响TIL体内抗肿瘤效果的主要因素。Tregs是T细胞的一种,主要指CD4+CD25+Treg,具有阻止自身免疫病和炎症疾病的发生,也能抑制有效的抗肿瘤免疫应答[1-3]。CD4+CD25+Treg约占人和小鼠外周血CD4+T细胞的5%-10%。大量研究表明,在大多数肿瘤患者中抗肿瘤免疫功能低下与 CD4+CD25+Treg有关[4-6]。目前研究发现多种肿瘤患者外周血和肿瘤区域及淋巴结中Treg的比重显著高于正常人。已经证实,通过各种途径清除CD4+CD25+Treg或下调其活性可显著增加其抗肿瘤活性[7-11]。从临床角度研究肿瘤患者体内CD4+CD25+Treg数量和功能的变化,揭示这种变化和疾病发生、发展的关系,可为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。本文探讨卵巢癌患者CD4+CD25+Treg的比例变化及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 20例卵巢癌患者均为2007年10月-2009年1月在本院妇产科住院患者,经手术病理均证实为上皮性卵巢癌。FIGO分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期2例,Ⅲ期12例,Ⅳ期3例。病理类型:16例浆液性上皮性卵巢癌,4例粘液性上皮性卵巢癌。年龄44-65岁,平均 56.3±12.7岁。10例正常对照组均为门诊健康体检者,年龄20-57岁,平均52.3±10.1岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 鼠抗人IgG抗体,FITC-抗CD25抗体、PE-CY5抗CD4抗体、FITC-抗CD69抗体及同型对照抗体均购自美国CALTAG公司。RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国HyClone公司。胰蛋白酶购自美国Sigma公司。卵巢癌细胞株SKOV3购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

1.2.2 PBLs,TILs,and TALs细胞分离 外周血利用胎牛血清2∶1稀释,利用密度梯度分离法分离,室温下2 500 rpm25分钟,获得PBLs。

肿瘤组织无菌条件下粉碎胰蛋白酶消化25分钟,取悬浮液过滤后,PBS洗3次,利用密度梯度分离法分离,室温下2 500 rpm25分钟,收集下层细胞,获得TILs。

腹水或腹腔冲洗液室温下1 500 rpm离心15分钟,利用密度梯度分离法分离,室温下2 500 rpm25分钟,收集下层细胞,获得TALs。

1.2.3 流式细胞仪 样品应用EPICS XL-ADC流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)上机检测,检测PBLs,TILs,and TALs细胞中CD4+CD25+T细胞的比例;卵巢癌患者CD4+PBL中CD69+细胞的比例。

1.2.4 细胞培养 卵巢癌细胞株SKOV3在加有10%热灭后胎牛血清的RPMI1640培养液中培养,80%汇聚后再在未加入胎牛血清的RPMI1640培养液中培养48小时,离心滤过后取上清,-20℃保存。

为了探讨卵巢癌细胞株培养液对CD4+CD25+调节性T细胞的效应,10例健康人 PBLs在 RPMI1640培养液中培养,培养72小时后加入卵巢癌细胞株SKOV3培养液。后者再分为加入PHA及未加入PHA两组,上机检测不同情况的CD4+CD25+T细胞的比例。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 卵巢癌患者CD4+CD25+调节性T细胞比例增加

卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的32.45%,与正常对照组(5.2%)相比明显增加,差异显著(P＜0.05)。见图1。

卵巢癌患者TILs和 TALs中CD4+CD25+调节性T细胞所占的比例分别为43.8%、33.6%;晚期卵巢癌患者 PBL、TIL及 TAL中 CD4+CD25+调节性 T细胞所占比例高于早期卵巢癌患者,但没有统计学意义(P＞0.05)。卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表达阴性。见图2。

2.2 卵巢癌细胞株SKOV3培养液可以增加CD4+CD25+T细胞的表达

正常健康人PBLs在RPMI1640加入50%卵巢癌细胞株SKOV3培养液(有或没有PHA,10 μ g/ml))中培养后,CD4+CD25+Tregs所占比例高于没有加入卵巢癌细胞株SKOV3培养液中的比例。见表1。

图1 A正常健康人PBLs中CD4+CD25+调节性T细胞流式检测结果 B-D卵巢癌患者PBLs、TILs及TAL中CD4+CD25+调节性T细胞流式检测结果

图2 卵巢癌患者 CD4+PBLs中 CD69的表达阴性

表1 卵巢癌细胞株培养液对CD4+CD25+Tregs的效应

3 讨论

近年来研究表明许多肿瘤抗原为自身抗原,CD4+CD25+tregs能抑制T细胞对外来和自身抗原的免疫应答,因而在维持对自身成分耐受的同时也会阻止机体对肿瘤细胞的免疫应答,从而导致了肿瘤的免疫逃逸。1999年Onizuka[12]首先通过实验证明CD4+CD25+Treg抑制针对肿瘤的免疫应答,使人们开展了对这类细胞和肿瘤相互关系的基础理论研究。

Wolf和Ormandy等[13-15]发现在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部CD4+CD25+Treg比例增高,且数量与患者肿瘤进展程度和预后呈负相关。Woo等报道大于30%肺癌患者CD4+PBLs and TILs共表达CD25[13]。本研究发现卵巢癌患者PBLs中CD4+CD25+Treg明显增加,而且晚期患者Treg相对更高,提示卵巢癌患者体内存在CD4+CD25+Treg增高。CD4+CD25+Treg增高可能激活了宿主对于肿瘤的免疫抑制作用。同时本研究还发现卵巢癌患者TIL中CD4+CD25+Treg所占比例明显高于PBLs和TALs中的比例,但是没有统计学意义,这提示肿瘤局部微环境中免疫受抑制更明显。CD69是T细胞活化的标记物之一。本研究发现卵巢癌患者CD4+PBLs中CD69表达阴性,提示卵巢癌患者 CD4+CD25+调节性T细胞增加并不是由于活化T细胞的增加。

肿瘤患者外周血、淋巴结和肿瘤局部CD4+CD25+Treg数量增加,这一现象可能的解释有两种:肿瘤诱导的调节性T细胞的增殖;或调节性T细胞对肿瘤抗原刺激的生理性增殖。至今仍缺乏实验室证据证明上述任何一种假说。为了探讨卵巢癌患者局部微环境中CD4+CD25+Treg增加的机制。本研究检测了健康人PBLs培养基中加入卵巢癌细胞株SKOV3培养液前后CD4+CD25+Treg的比例变化,结果显示加入卵巢癌细胞株SKOV3培养液后CD4+CD25+Treg的比例增加。为了进一步证实这种变化不是由于活化T细胞增殖的原因,本研究继续在上述加入卵巢癌细胞株SKOV3培养液的PBLs培养基中加入PHA,CD4+CD25+Treg的比例同步增加。因此推测卵巢癌上皮细胞分泌一定的可溶性分子,他们诱导卵巢癌患者外周血及肿瘤局部微环境中的CD4+CD25+Treg增加。

本研究结果显示卵巢癌患者体内CD4+CD25+Treg增加,推测是由于卵巢癌上皮细胞分泌的可溶性分子有关。由此,探讨卵巢癌局部微环境中CD4+CD25+Treg增加的原因及如何清除CD4+CD25+Treg或下调其活性,成为提高TIL卵巢癌免疫治疗效果的焦点。

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The detection of CD4+CD25+regulatory T cells of ovarian cancer patients and clinical significance

WEN Yan,SUN Xiaoyan,HE Jin,et al.(The First Hospital of Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the frequence of the CD4+CD25+regulatory in the patientswith ovarian carcinoma and its possible mechanism.MethodsThe percentages of CD4+CD25+T cells in the peripheral blood lymphocytes(PBLs),tumorinfiltrating lymphocytes(TILs)and tumor associated lymphocytes(TALs)from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry.The expression of CD69 on CD4+PBLs from thepatients was detected.PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA(phytohemagglutinin)stimulationfor 72 hours,then the percentage of CD4+CD25+T cellswas detected.ResultsCD4+CD25+T cells in the PBLsfrom patientswith ovarian carcinoma were significantly increased comparedwith the control.The percentage of CD4+CD25+T cells in TILs was higher than that inPBLs and TALsfrom the patients,but not significantly.The expression of CD69 on CD4+PBLs from the patientswas negative.ConclusionThere is anincreasing of the proportion of CD4+CD25+T cells in PBLs,TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma,which probably results from up-regulation ofsoluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.

Ovarian carcinoma;Immunosuppression;regulatory T cell

R737.31

A

1007-4287(2010)09-1402-04

吉林省科技厅白求恩基金资助(20070175)

*通讯作者

2009-12-07)