pH值对产氢细菌 Ethanoligenens harbinense YUAN-3的影响

谢天卉,赵 鑫,路 璐,吴 迪,付 娜

(哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室,哈尔滨 150090)

氢气以其清洁、高效、可再生等特点,成为人们理想的能源载体之一.产生氢气的方法有很多种,其中发酵法生物制氢技术以其环境友好、不消耗化石燃料、产生清洁能源等特点,日渐得到人们的关注[1-3].但产氢效率不高始终制约着发酵法生物制氢技术的规模化进程.分离筛选高效产氢细菌,并为优化生态因子是解决该问题的方法之一[4-5].

Ethanoligenens harbinenseYUAN-3(哈尔滨产乙醇杆菌)[6-8]是从乙醇型发酵生物制氢反应器中分离得到一株产氢细菌,其主要液相代谢产物为乙醇和乙酸.该细菌不仅具有较高的产氢效能,而且具有自凝集的特性,易形成菌粒而沉降在反应器中,避免菌种流失,适合工程应用.

初始 pH值是影响产氢细菌生长和产气的重要生态因子之一,大多数产氢细菌的最适 pH值都集中在中性,pH值过高或过低都会制约产氢细菌的发酵过程,影响细菌代谢.Enterobacter HO-39的产氢最适 pH值范围是 6.0～7.0,并可以在 pH值为 3.3的酸性环境产气[9];Citrobacter Y19的最适产氢 pH范围也是 6.0～7.0,但是在 pH值为 4.0时,丧失产氢能力[10].因此,探讨 pH值对产氢细菌 E.harbinenseYUAN-3的产氢和生长的影响对揭示其生理生态学特性具有重要的意义.本文利用E.harbinenseYUAN-3作为研究对象,研究了不同初始 pH值对其生长、产氢等方面的影响,以期能够为菌株 YUAN-3在实际工程中的应用提供指导.

1 材料与方法

1.1 菌株

产氢细菌 Ethanoligenens harbinense YUAN-3[6-8],分离自活性污泥,由本实验室保存.

1.2 间歇产氢实验

将处于对数生长期的菌体以 10%(V/V)的比例接种到不同磷酸盐质量浓度的培养基中,在间歇实验装置上进行厌氧发酵产氢实验,35℃条件下,130 r/min振荡培养,排水法测定气体体积.培养基组分如下:葡萄糖 10 g/L,蛋白胨 4 g/L,酵母粉 1 g/L,NaCl 4 g/L,MgCl2·6H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 0.1 g/L,L-半胱氨酸 0.8 g/L.通过磷酸氢二钠和柠檬酸的不同配比使培养基的初始 pH值分别为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0,考察初始 pH值对于 YUAN-3生长、产气等情况的影响,每组 5个平行样.

1.3 发酵产物的分析

液相产物测定使用 Agilent 4890型气相色谱仪,30m×0.53 mm HP-FFAP熔融石英毛细管柱,氢火焰检测器,氮气作载气,流速 60m L/min,氢气流速 60mL/min,进样口、炉温、检测器温度分别为 220、180、300 ℃.样品在 5 000 r/min下离心15 min,取上清液 1 m L,加入一滴 6 mol/L HCl溶液,取 1μL进样.

气相产物测定使用另外一台 Agilent 4890型气相色谱仪,其中 15 m×0.530 mm毛细管柱(19095P-QO3,Agilent),热导检测器,氮气作载气,进样量 500μL.

生物量主要用细胞干重来衡量.发酵结束后,将发酵液在 5 000 r/min下离心收集菌体,经生理盐水重悬、洗涤 2次后 80℃下烘干至恒重,称重葡萄糖的测定采用上海荣盛生物技术有限公司生产的葡萄糖(Glu)测定试剂盒——GOD-PAP法pH值采用 pH-S25型酸度计进行测量.

2 试验结果与讨论

2.1 pH值对 YUAN-3生长的影响

YUAN-3在试验的各个 pH值都表现出一定的生长能力,见图1.在 pH值 4.0时,YUAN-3的细胞干重最小,为 0.34 g/L-培养基.随着 pH值的不断增加,细菌的生物量也逐渐增加.在 pH值7.0时,细胞干重达到最大,为 0.59 g/L-培养基,此后细菌生物量略有下降.可见 YUAN-3在中性和弱酸的 pH值范围内,都可以很好的生长,并保持较高的生物量.

通常情况下,乙醇型生物制氢反应器的 pH值维持在 4.5～5.0左右,而将 YUAN-3投加到生物制氢反应器中是一种很好的生物强化的手段.尽管在初始pH值 4.5～5.0的范围内并不是 YUAN-3生长最旺盛的阶段,但 YUAN-3在弱酸的情况下,依然能够保持较高的生物量,说明 YUAN-3具有较高的应用价值.

图1 初始 pH值对 YUAN-3生长的影响

2.2 pH值对 YUAN-3产气能力的影响

随着初始 pH值的提高,生物气、氢气以及氢气的含量(V/V)都呈现出先升高再降低的趋势(图2).在 pH值为 6.0时,生物气和氢气均达到最大,分别为 1 886 m L/L-culture和 997 mL/L-cul ture,此时的氢气体积含量也达到最大为 52.8%在 pH值从 4.0到 8.0的范围内,YUAN-3均能产气,且在 pH值大于 4.5开始,YUAN-3的产生氢气的体积百分含量始终大于 40%,说明 YUAN-3是一株具有较强耐酸能力的产氢细菌,能够在弱酸性环境中维持较高的产氢能力.

图2 初始pH值对YUAN-3产气能力的影响

随着初始 pH值的不断增加,YUAN-3的平均产氢速率和比产氢率也先升高再逐渐降低(图3).在 pH值为 6.0时,平均产氢速率达到最大,为5.75mmolH2/g-CDW·h,随后呈逐渐降低的趋势.这说明,在 pH值为 6.0时,产氢细菌具有较高的细胞产氢活性,pH值过低会抑制细菌的生长和产氢;pH值高于 6.0时细菌的产氢量略有下降,细胞活性有所降低.同样 YUAN-3的比产氢率也在pH值为 6.0时达到最大,为 2.32 molH2/mol-葡萄糖.这说明此时的细菌还具有良好的葡萄糖转化率.

图3 初始 pH值对 YUAN-3平均产氢速率和比产氢率的影响

2.3 pH值对 YUAN-3液相末端产物的影响

发酵液相末端产物主要是乙醇和乙酸,二者的量都随 pH值升高而呈先增加再降低的趋势(图4),这种现象与细菌的产氢的情况是一致的.液相末端产物的增加主要是由于中性范围更有利于YUAN-3的发酵造成的.本次发酵利用的是缓冲溶液,故缓冲溶液的缓冲能力在发酵结束的 pH值得以体现,随着初始 pH值的增加,发酵结束时的pH值略有升高.在初始 pH值为 4.0时,发酵终止时 pH值为 3.78,而初始 pH值为 8.0时,发酵终止时的 pH值为 4.65.初始 pH值在 6.0～7.0时,发酵终止的 pH值有所下降,是因为在这个初始pH值范围,发酵进行的相对彻底,产生了大量的乙酸,导致此时 pH值有小幅的下降.而后来终止时的 pH值又逐渐升高,一方面是因为初始 pH值较高,另一方面是因为发酵过程相对于 pH值 6.0～7.0来说,进行不够彻底.平时未使用缓冲溶液时,发酵终止时 pH值常常低于 3.5,可见缓冲溶液在发酵过程中发挥了一定作用,在一定程度上减缓了pH值下降的速度,但是由于乙酸的大量产生,缓冲溶液并不能改变 pH值下降的趋势.

图4 初始pH值对 YUAN-3代谢产物的影响

此外 YUAN-3具有自凝集的能力,能够通过细菌的互相包裹形成菌粒而沉降在培养基底部,培养基自始至终都是清澈的.在不同的 pH值,YUAN-3形成的菌粒大小不同,用肉眼观察在 pH值从5.0～8.0的范围内,YUAN-3形成的菌粒平均直径可以达到 4～5 mm,而 pH值小于 5.0,形成的菌粒直径明显变小,只有 2mm左右,可见 pH值也在一定程度上影响 YUAN-3的凝集能力.

3 结 语

通过间歇试验考察不同 pH值对于产氢细菌YUAN-3生长和产气的影响,可以发现在初始 pH值为 7.0时,细胞干重达到最大,为 0.59 g/L-培养基.在含有缓冲体系的培养基初始 pH值为 6.0时,平均产氢速率和比产氢率都达到最大,分别为5.75 mmolH2/g-CDW· h和 2.32molH2/mol-葡萄糖.因此,可以将 YUAN-3的初始培养基 pH值范围控制在 6.0～7.0,可以获得更多产氢活性较高的产氢细菌.YUAN-3可以在弱酸性环境中生长和产气,是一株具有工程应用价值的产氢细菌.

[1] 李建政,任南琪.生物制氢技术的研究与发展[J].能源工程,2001,(2):18-20.

[2] DAS D,NEJAT V T.Hydrogen production by biological processes:a survey of literature[J].Int.J.Hydrogen Energy,2001,26:13-28.

[3] MIYAKE J,MASTSUNAGA T,PIETRO A S.Biohydrogen II:an Approach to Environmentally Acceptable Technology[R].Elsevier Science Ltd.2001,15:3-32.

[4] OH S,VAN GS,LOGAN BE.The relative effectiveness of pH control and heat treatment for enhancing biohydrogen gas production[J].Environ.Sci.Technol.,2003,37:5186-5190.

[5] OH Y K,SEOL E H,LEE E Y,et al.Fermentative hydrogen production bya new chemoheterotrophic bacterium Rhodopseudomonas Palustris P4[J].Int.J.of Hydrogen Energy,2002,27 1373-1379.

[6] XING D,REN N.Ethanoligenens harbinense gen.nov.,sp nov.,isolated from molasses waste water[J].Int.J.Syst Evol.Microbiol.,2006,56(4):755-760.

[7] XING D,REN N,WANG A,et al.Continuous hydrogen production ofauto-aggregative Ethanoligenensharbinense YUAN-3 under non-sterile condition[J].Int.J.Hydrogen Energy,2008,33:1489-1495.

[8] RENN,XIE T,XING D.Composition of extracellular polymeri substances influences the autoaggregation capability of hydroge-producing bacterium Ethanoligenens harbinense[J].Bioresource Technol,2009,100(21):5109-5113.

[9] YOKOIH,TOKUSHIGE T,HIROSE J,et al.Hydrogen production by immobilized cellsof Enterobacter aerogenesstrain HO-39[J].J.Ferment.Bioeng,1997,83(5):481-484.

[10] OH Y K,SEOL E H,KIM JR,et al.Fermentative biohydrogen production by a new chemoheterotrophicbacterium Citrobacter sp.Y 19[J].Int.J.Hydrogen Energy,2003,28:1353-1359.