神经突触研究方法的进展

陈子秋,肖启贤 综述,郭伟韬 审校

(1.广东医学院,广东 湛江 524032;

2.广东医学院附属医院骨外科,广东 湛江 524001)

·综 述·

神经突触研究方法的进展

陈子秋1,肖启贤1综述,郭伟韬2审校

(1.广东医学院,广东 湛江 524032;

2.广东医学院附属医院骨外科,广东 湛江 524001)

神经元是神经系统的结构和功能单位,具有接受、整合和传递信息的功能,神经元通过一级级严谨有序的方式形成了复杂的神经网络。而突触则是整个系统最小的功能单位,通过突触的连接使神经元相互之间以及神经元和效应器得以传递信号。突触不仅是研究神经系统正常电生理和功能的基础,同时也是研究神经系统疾病机制的突破口。本文就目前有关神经突触研究方法的概况和新进展作一综述。

神经突触;电子显微镜;电生理;可视荧光技术

神经系统是生命活动中起整合和调节作用的信息系统。神经元是神经系统的结构和功能单位,具有接受、整合和传递信息的功能,神经元通过一级级严谨有序的方式形成了复杂的神经网络。突触(Synapse)是神经元之间相互接触的部位,在反射活动中各种神经冲动都要通过突触进行传导,可以说突触是整个神经系统传递的最小功能单位,因此各种神经系统相关的研究都是以突触为突破口的。而是否能选择一种符合研究方向的突触检测方法则很大程度上决定了研究的成败。

1 形态学观察法

经典的突触由突触前部、突触间隙和突触后部三部分组成。突触前部和突触后部相对应的细胞膜较其余部位略增厚,分别称为突触前膜和突触后膜,两膜之间的狭窄间隙称为突触间隙。在突触前膜部位的胞浆内,含有许多突触小泡 (Synaptic vesicle)以及一些微丝和微管、线粒体和滑面内质网等。突触小泡是突触前部的特征性结构,小泡内含有化学物质,称为神经递质(Neurotrans mitter)。各种突触内的突触小泡形状和大小颇不一致,是因其所含神经递质不同。

观察突触形态最早使用的方法是普通光学显微镜,但是在中枢神经系统突触前终末的容积一般只有 10-15L。因此,我们很难用光学显微技术分析在整个突触水平发生了什么,也无法轻易的分辨出神经突触终末的细微空间结构[1]。但现在一些新的技术也逐渐用于突触研究。

1.1 电子显微镜 (Electron microscope,EM)目前常用的主要有透射电子显微镜 (Transmission electron microscopy,TEM)、能量过滤透过式电子显微镜 (Energy filtered transmission electron microscopy,EFTEM)、扫描电子显微镜 (Scanning electron microscope,SEM)。EM主要用来观察突触数目和超微结构。20世纪 50年代中期,正是电镜应用于神经系统的研究,突触的结构才被认可。早期对树突的电镜观察证实了游离核糖体和膜结合核糖体的存在。国内有学者[2]通过 TEM观察到饮酒后的小鼠海马CA-1区突触结构的突触后膜致密物质厚度、突触活性区长度及突触间隙宽度均显著性变小,从而在形态学方面证明了酒精可以引起突触的可塑性变化,并影响神经冲动的传递功能甚至学习记忆。Ventura等[3]利用三维电镜技术观察了成年大鼠海马 CA-1区域中星形胶质细胞和突触的空间位置关系,为更直观地了解细胞的网络结构提供了新的工具。利用 EM观察时不足之处是样本必须在真空中观察,因此无法观察活样本。在处理样本时可能会产生样本本来没有的结构,这加剧了此后分析图像的难度。

1.2 原子力显微镜 (Atomic force microscope,AFM) AFM是一种利用原子、分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针,被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针非常靠近样品时,其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲,偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像,就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。相对于扫描电子显微镜,原子力显微镜具有许多优点:首先,不同于电子显微镜只能提供二维图像,AFM可以提供真正的三维表面图。同时,AFM不需要对样品的任何特殊处理,如镀铜或碳,从而避免了这种处理对样品造成的不可逆性伤害。其次,电子显微镜的运行需要在高真空条件下,而原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作,这样可以更方便的研究生物宏观分子,甚至活的生物组织。Parpura等[4]曾用原子力显微镜对固定的和活的海马神经元进行了成像。AFM的缺点在于成像范围太小、速度慢,受探头的影响太大。此外AFM购买和维护的价格都比较高,为其普及增加了难度。

2 免疫组织化学法

指在抗体上结合荧光或可呈色的化学物质,利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应,检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在,此方式不仅可以用来测知抗原的表现量,而且可观察抗原所表现的位置。具有高度特异性、灵敏性和精确性。目前已发现的一系列突触蛋白家族成员 (突触蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)大部分可作为目标抗原证明突触的存在和位置,其中突触素是突触囊泡膜上的特异性蛋白质,与神经递质的释放直接相关,有研究者建议对其检测可作为中枢神经系统中突触功能建立、维持和(或)丧失、恢复的敏感指示器。然而,虽然通过辨别突触蛋白来确认新突触发生已经得到广泛应用,但用突触蛋白的斑点状定位辨别突触不是绝对可靠的,尤其是一些新生突触在形成过程的早期还没有某种突触蛋白时更是如此,此法还存在抗体的特异性与交叉反应的问题。因此,对这种方法的结果应作仔细分析。

3 可视荧光技术

功能是突触发育成熟的标志,可视荧光技术能进行实时显像,使对活体突触功能进行研究更为容易。荧光标记生物膜及荧光标记蛋白是最常见的可视成像技术。它能特异性地标记突触囊泡,发出荧光,而又不影响突触囊泡的活性和运转。在突触事件中依照荧光强度的变化就可以推断相应的神经胞吞及胞吐的程度,跟踪突触囊泡运输循环过程。

3.1 荧光膜追踪剂 F M1-43标记技术 F M1-43属于苯乙烯类荧光染料中最常用的一种,是一种具有双极性的荧光染料,亲水基团与亲脂基团分别位于分子的两端。它可以选择性地对正在进行外吐和内吞的分泌型生物膜进行染色。FM1-43在静息状态下依靠其亲脂尾部插入脂质膜外叶,给予一定的外部刺激 (实验中一般选择高钾刺激或电刺激)诱发递质释放后,一部分荧光染料就会随着突触囊泡的内吞而成为突触囊泡膜的一部分。刺激过后,残留在膜外叶的剩余染料则可用洗脱液洗脱下来[5-6]。当 FM1-43游离在水溶液中时,它的荧光强度很弱几乎觉察不到;但当它们被插入至疏水环境时,它的荧光强度将呈几十倍的增强[7]。因此,此时细胞内的 FM1-43的荧光强度在一定程度上就可以定量地反映这一次刺激诱发下胞吞的程度。如果进行再次刺激,苯乙烯类染料就会随着囊泡的胞吐,与神经递质一起释放到突触间隙,而此时荧光强度的减弱就可以反映出胞吐的程度。Ryan[8]用 FM1-43获得了培养的海马神经元轴突和树突之间的突触连接的图像,并将其应用在运动的突触囊泡中,可在树突及突触体上观察到标记点,通过计算荧光强度对突触功能进行分析。国内周涛等[9]使用未分化的 PC12细胞作为种植神经元的来源,在神经生长因子(NGF)作用下分化成神经元样细胞,并与原代皮质神经元建立模拟移植环境的共培养体系,利用FM1-43造影研究了细胞移植环境中宿主细胞与移植细胞突触形成的可能性。FM1-43自身也存在一些局限性,这主要体现在时间分辨率较差,无法提供毫秒级的变化资料及难以排除一些来自非突触囊泡产生的噪声的干扰等方面。

3.2 Fura-2荧光探针技术 Fura-2与钙螯合剂 EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)一样,具有四羧酸的 Ca2+螯合中心,能特异性与 Ca2+结合,不同的是 Fura-2可发出荧光,并且与 Ca2+结合后其荧光光谱发生变化。其具荧光强度高、波长漂移、反应速度快、自身荧光小、对 Ca2+选择性好和测定灵敏等优点,系目前测定细胞内 Ca2+浓度应用最广的荧光指示剂[10-11]。Fura-2可与胞浆内游离 Ca2+结合形成 Fura-2-Ca2+复合物。Fura-2与 Fura-2-Ca2+复合物的最大激发光波长分别为 380nm和340nm,其发射光的强度与Ca2+浓度呈正比,据此可测定 Ca2+及其变化。正常情况下突触的传递过程,是神经冲动沿轴膜传至突触前膜时,触发前膜上的电压门控钙通道开放,细胞外的 Ca2+进入突触前部,在ATP和微丝、微管的参与下,使突触小泡移向突触前膜,以胞吐方式将小泡内的神经递质释放到突触间隙。因此突触内 Ca2+的浓度可反映突触的功能活动,国内已有学者利用 Fura-2测定突触体胞浆游离 Ca2+浓度[12],提供了正常突触体内 Ca2+浓度的相关数据。Fura-2荧光染料的局限性,容易受 pH、温度、外界 Ca2+的影响,在实际操作中需注意。

3.3 谷氨酸(Glu)递质释放的连续荧光分析法

中枢兴奋性神经递质谷氨酸 (Glu)从突触前的释放,是 Glu神经传导的重要部分,在许多 Glu释放的分析检测技术中,最近发展的 Glu连续荧光分析法有许多优点。此法快速而灵敏度高,可对 Glu释放作动态的检测。原理:从突触前膜释放的 Glu,在谷氨酸脱氢酶 (GDH)作用下,可与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP)发生氧化还原反应,生成烟酰胺腺嘌呤二核酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)以及α-酮戊二酸[13]。随着NAD或 NADP被还原成NADH或NADPH,会引起荧光快速增加而为荧光光度计检测到。通过标准 Glu的加入,可对释放的Glu精确定量。Glu的释放和摄取是其突触调控中很重要的方面。含 Glu的囊泡在去极化条件下,是依赖于 Ca2+的胞泌机制释放的[14]。Glu释放的主要部分发生在 Ca2+内流的平台期,是由 Ca2+通过非失活性通道内流而触发的。通过对突触体 Glu释放的分析,不仅为检测突触功能提供了另一可靠指标,也为研究神经系统相关疾病提供了有效的研究方法。例如朱晓峰等[15]研究致痫剂马桑内酯对谷氨酸摄取和释放功能的影响,阐明了马桑内酯致痫的可能机制是使谷氨酸释放增加,摄取减少,突触间隙谷氨酸聚积所造成。随着分析、检测 Glu释放技术的发展,不但可以探明 Glu从突触前膜的释放机制这一神经生物学上的重要问题,而且也能提供一种更便捷的方法,去研究在不影响 Glu的正常神经传导条件下,对 Glu异常释放,造成对 Glu受体的滥刺激所致神经毒性的拮抗。

3.4 绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP) 随着光学显微镜的发展,荧光标记蛋白技术已成为许多活体成像研究中必不可少的一种工具。许多学者将其应用于活体细胞突触形成的研究,其中应用最广泛的荧光标记蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。它是一种功能独特的蛋白质,编码 238个氨基酸残基,分子量为 2688Da。该蛋白受到紫外或蓝光激发时可以自身催化形成发色结构并发出绿色荧光,其吸收波长为 395nm,发射波长为 509nm,从而可以被多种方法检测。与其他荧光标记蛋白不同,GFP检测不需要底物,在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活。Ahmari等[16]将GFP标记突触前囊泡相关膜蛋白,又称突触小泡蛋白(Synaptobrevin)。利用实时荧光显像技术发现突触前囊泡在神经元与它接触的部位接触前就可以识别到,一旦神经元和它潜在的靶细胞建立实质性的接触,这些囊泡就会在突触形成部位进行逐步释放。此外,还可将 GFP作为蛋白质标签 (Protein tagging),即利用DNA重组技术,将目的基因与 GFP基因构成融合基因,转染合适的细胞进行表达,然后借助荧光显微镜观察活体细胞内标记的蛋白质位置和动态变化。Hartmann等[17]将绿色荧光蛋白 (GFP)标记脑源性神经营养因子(BDNF)构建 GFP-BDNF融合蛋白的质粒,然后将质粒转染原代培养的大鼠海马神经元,通过实时检测海马神经元间谷氨酸型突触部位 GFP-BDNF囊泡中荧光强度的变化来研究绿色荧光蛋白标记的BDNF的分泌情况。研究发现高频刺激能激发谷氨酸型突触囊泡中BDNF的释放,并且这种释放依赖于突触后离子移变谷氨酸受体及突触后钙离子内流的激活。GFP荧光检测的一大缺点就是没有放大作用,它不能像酶一样通过加工无数的底物分子而将信号放大。因此 GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,此外,检测的灵敏度还有待进一步提高;荧光强度的非线性性质使其定量非常困难。不过相信随着通过对 GFP基因进行定点突变,一系列带有不同的激发和发散波长的GFP突变株的开发,以及随着检测技术的发展和检测方法的不断完善,GFP标记系统将比现有的标记系统具有更多的优势。

4 电生理方法

神经突触的主要功能就是传递信息。信息传递的基本过程是突触前神经末梢释放神经介质,神经介质作用于突触后膜上的受体,引起动作电位。因此,在神经突触发育的研究中电生理指标有其特殊的重要性,电生理方法也是研究突触是否具有成熟功能的最有效的方法。早期研究多使用电压钳技术。目前,应用最广泛的是 Sakmann和 Neher[18]于1976年建立的膜片钳技术 (Patch clamp recording technique)。其突出优点是能够在维持细胞兴奋过程中膜电位恒定的同时,直接记录离子通道电流,反映单一的或多个的离子通道分子活动。其基本原理是用微玻管电极接触细胞膜,以千兆欧姆以上的阻抗使之封接,使与电极尖端开口处相接的细胞膜小区域 (膜片)与细胞膜其他部分在电学上绝缘,在此基础上固定电位,并对此膜片上离子通道的离子电流进行监测记录,以此来反映细胞膜上单一的或多个的离子通道分子活动的技术。膜片钳主要有以下几种记录模式:细胞吸附模式、膜内面向外模式、膜外面向外模式、全细胞模式、穿孔膜片模式、开放细胞吸附式、穿孔囊泡模式等。其中最常用的是全细胞记录模式。Song等[19]报道,把 GFP敲入 (GFP+)的成体神经干细胞和新生鼠海马区原代的星形胶质细胞和神经元在无血清培养基中共同培养 2-4周,在第 6天时加入阿糖胞苷,以选择非有丝分裂的神经元。在共同培养两周时,电镜检查发现 GFP+神经元和原代培养的神经元既形成了对称性的突触结构,又形成了非对称性的突触结构。全细胞膜片钳记录在注入去极化电流 (0.5-1nA)条件下可以反复激发动作电位的发生,且能够被 0.5μmol/L的河豚毒素 (Tetrodotoxin,TTX)所阻断。Ullian等[20]在培养两周后的大鼠视网膜神经节细胞 (Retinal ganglion cells,RGCs)测量到其由胶质细胞引起的自发突触活性的显著增高。

电生理实验方法也有一些欠缺和不便之处,如膜片钳需要干净的细胞膜表面,因此对细胞条件要求较高,且会破坏细胞的正常代谢和细胞骨架等。膜片钳技术如果能进一步改良,在体内环境中不改变细胞生理状态的情况下检测细胞的电生理特性,则能够更准确地反映细胞的生存状态,评价细胞的突触生理功能,为神经干细胞的基础研究、临床应用及移植后评价提供更为可靠的客观依据。

5结语及展望

虽然本文将突触的研究方法分开介绍,但在神经突触发生发育的相关研究中往往需要多种方法的综合运用,没有超微结构的详细观察,对中枢神经系统突触发生和发育的描述就不够完善;而缺乏相应的电生理功能的研究,结构观察的任何结果也不完全可信。譬如上述的膜片钳技术和其他方法的结合,如和膜通道蛋白重组技术、同位素示踪技术和光谱技术结合起来,可以协同对离子通道进行全面而深入的研究;如和单细胞逆转录多聚酶链式反应(Single cell RT-PCR)的结合,可以从电生理学角度和分子生物学角度揭示神经干细胞(神经元)的功能活动与结构之间的联系,检测单个细胞上离子通道的药理学和生物学特性,在同一个细胞上筛选出某些特定mRNA的表达,从而在基因水平鉴定形态相似而功能不同的细胞。因此,若要全面深入地了解神经突触的发生和发育进行就需要综合以上手段,进行多模式研究。目前国内已有报道用纳米电极监测囊泡及及突触内神经信号的分子传导[21]。

随着神经系统生理和病理机制研究的不断深化,对突触功能更加详尽的阐述将成为该领域的关键性问题。我们也更加期待更新、更先进、更完善的检测工具或检测方法的诞生。

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R338.1+3

A

1003—6350(2010)19—122—04

广东省自然科学基金(编号:8452402301001081)

广东省医学科学技术研究基金项目(编号:WSTJJ20081030410305196909162017)

陈子秋(1984—),男,湖北省十堰市人,在读硕士研究生。

2010-06-22)