人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定

牛成伟，曹 凯

（承德医学院，河北承德 067000）

血管内皮细胞的功能是否正常与保持通畅的血液循环，维持正常的血管舒缩状态密切相关，在病理因素作用下发生的内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的始动因素[1]。采用培养的内皮细胞进行科学研究是一种普遍的实验方法。本研究旨在建立一种简单，能够获得较多细胞数目，且活力良好的人脐静脉内皮细胞的培养方法，为进一步进行相关研究提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新生儿脐带：由承德医学院附属医院提供。

1.1.2 试剂：DMEM培养基，GIBCO产品；优质胎牛血清，澳大利亚；胶原酶Ⅰ，SIGMA公司产品；碱性成纤维生长因子（bFGF），美国E.coli产品；Ⅷ因子相关抗原、通用SP系列试剂盒、DAB显色试剂盒为中杉金桥生物技术有限公司。完全培养基成分：80% DMEM：20%胎牛血清；bFGF，20ng/ml；青霉素，100U/ml；链霉素，0.1g/L。

1.1.3 仪器：HERAcell 150型CO2孵育箱，德国Heraeus公司；LEICA DMIL 090-135.001型倒置显微镜，德国Wetzlar GmbH公司；净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的原代培养：无菌条件下取新生儿脐带约25cm，剪去两端夹痕，挤出残留血液，PBS冲洗至冲洗液无色。将血管下端夹紧，注入0.1%胶原酶Ⅰ与0.25%胰酶、0.02%EDTA（V/V=1:1）的混合消化酶至静脉充盈，置37℃温箱中消化13min。收集消化液于锥形瓶，迅速加2ml小牛血清终止消化；并用D-Hanks液冲洗脐静脉，将冲洗液一并收集在锥形瓶中，离心10min；弃上清，加入完全培养液5ml，混匀后接种于25cm2培养瓶中培养。24h更换培养液，以后每隔2d换液一次，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞的传代培养：原代培养的内皮细胞达80%以上融合时，加入0.125%胰酶、0.01%EDTA，常温下消化。镜下观察细胞出现皱缩、细胞间隙增宽、细胞变圆，立即加入含血清的培养液灭活，停止消化。用吸管轻轻的吹打，使仍贴壁的细胞脱落，离心。弃上清液，加入2ml完全培养基，制成均匀的细胞悬液，计数，按密度1.0×105个/ml接种于25cm2的培养瓶中继续培养。

1.2.3 人脐静脉内皮细胞的鉴定：将培养的细胞接种到预先放入多聚赖氨酸包被过的盖玻片的培养皿内，进行细胞爬片，待细胞生长至80%融合时，终止培养。丙酮固定10min，3%H2O2浸泡30min，山羊血清封闭，加入兔抗人Ⅷ因子IgG抗体（一抗）4℃过夜，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片后显微镜下观察。以胞质内出现棕黄色颗粒为阳性反应，以PBS液代替一抗作为阴性对照。

2 结果

2.1 形态学观察 原代细胞呈单层生长，边界清楚，形态为卵圆形。培养3-4d融合，呈典型的铺路石状镶嵌排列。传代细胞的形态和生长特点与原代细胞类似。

2.2 人第Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测 细胞质内可见棕黄色颗粒，胞核为蓝色，说明细胞内有内皮细胞特有的第Ⅷ因子相关抗原存在；对照组为阴性反应。

3 讨论

人脐静脉作为内皮细胞的材料来源，具有取材容易、操作方便的特点，且与各种实验动物相比，其实验条件更符合人体情况，结果更具有意义。在培养细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法三种。前两种易混杂其它血管壁细胞，近年已逐渐被酶消化法取代[2]。胰蛋白酶、胶原酶均可用于消化血管内皮细胞，但胰蛋白酶对内皮细胞的损伤较大；胶原酶作用较温和，但价格昂贵，限制了其在大规模实验研究中的应用。本研究采用胰蛋白酶、胶原酶等比混和消化液对内皮细胞进行消化，细胞生长良好。

本研究认为，影响细胞贴壁、生长和融合的因素包括：①脐带应新鲜，取下后立即放入冷D-Hanks液中，在4h内完成内皮细胞的培养，有利于细胞贴壁和生长。②掌握消化酶的浓度和时间非常重要。预实验时采用胶原酶Ⅰ与胰蛋白酶、EDTA等比混和消化液分别消化8min、13min和18min，发现消化13min，获取的内皮细胞数量最多，而成纤维细胞和平滑细肌细胞则较少被消化下来，且内皮细胞的生长、增殖状态良好。③人脐静脉内皮细胞是一种低增殖能力的细胞，需加入生长刺激因子以促进细胞生长。其它研究者的实验，多添加血管内皮生长因子。血管内皮生长因子能专一性的促进内皮细胞增殖，但因为价格昂贵，很难推广应用[3]。本研究加入价格低廉的bFGF。bFGF是一种多效能的细胞生长因子，可促进细胞分裂增殖，增强有丝分裂活性[4]。

综上所述，本研究的人脐静脉内皮细胞分离、培养、鉴定的方法简捷易行，成功率较高，能获得大量内皮细胞，能很好地满足实验研究的需要。

[1]Mallika V,Goswami B,Rajappa M.Atherosclerosis pathophysiology and the role of novel risk factors:a clinicobiochemical perspective[J]. Angiology,2007,58（5）:513-522.

[2]王立岩，佟晓红，宫桂兰，等.人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察[J].白求恩医科大学学报，2000，26（1）：26-28.

[3]Plouet J,Moro F,Bertagnolli S,et al.Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is required for its mitogenic effect[J].J BiolC hem,1997,272:13390-13396.

[4]Sohn YD,Lim HJ,Hwang KC,et al.A novel recombinant basic fibroblastgrowth factor and its secretion[J].Biochem Biophys Res Commun, 2001,284（4）:931-936.