转基因技术在犬繁育中的应用

叶俊华

转基因技术在犬繁育中的应用

叶俊华

转基因技术是生命科学前沿技术之一。它是指将人工分离和修饰过的外源基因导入到生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术，可分为转基因动物与转基因植物两大分支。科学家的初衷是想利用该技术造福人类，使之既可加快农作物和家畜品种的改良速度，提高人类食物的品质；又可以生产珍贵的药用蛋白，为患者带来福音。近年来，动物转基因技术发展十分迅猛，除有转基因猪、鼠、鱼、兔、牛、羊的成功报导外，2009年，已有转基因犬的成功问世。本文就转基因技术及转基因犬研究现状与前景作一简要介绍。

转基因技术相关概念

基因（gene）：人们常说的基因，也称为遗传因子，是生物遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。根据科学家已绘成的犬基因草图，犬的基因数量与人和其他哺乳动物的大体一致，含有大约25亿对DNA碱基。大约有几万个基因，储存着生命孕育、生长、凋亡过程的全部信息，通过复制、表达、修饰，完成生命繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。基因是生命的密码，记录和传递着遗传信息。生物体的生、长、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。

转基因（Transgene）：所谓转基因，是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有优良遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出人类所需要的生物制品，用于医药、食品等方面。

转基因技术（Transgene technology）：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”（Genetically modified organism，简称GMO）。通俗的讲：转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状和消费品质等方面向人类需要的目标转变。

几种主要的动物转基因技术

世界上已报道了多种生产转基因动物的方法，主要有四类：第一类是融合法，包括精子载体法、微细胞介导融合等；第二类是化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法等；第三类是物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等；第四类是病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等。但真正成熟并可以稳定生产转基因动物的方法主要有三种：即核显微注射法、精子介导法和核移植法等基因转移方法。基因打靶技术和胚胎干细胞（ES）介导技术是近年来新兴的转基因技术，具有很好的发展前景。

核显微注射法：核显微注射技术是动物转基因技术中最常用的方法。它是指在显微操作系统辅助下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合后，然后将胚胎进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的转基因片段。这种方法的缺点是效率低、位置效应(外源基因插入位点随机性)造成的表达结果存在不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。

精子介导的基因转移技术：精子介导的基因转移是指把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母体所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的1/10；其次，由于它不涉及进行动物处理，因此，可以用动物的生产群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。该方法是转基因技术中非常有发展前途的一种方法，可以与体外受精、早期胚胎阳性选择和胚胎超低温保存技术相结合，使转基因技术更加实用化、简单化。

核移植转基因技术：体细胞核移植和转基因相结合是近年来新出现并广泛使用的一种转基因技术。该方法是先把外源基因导入到供体细胞内，使外源基因整合到供体细胞染色体上，然后将供体细胞的细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到同期发情的母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。核移植转基因技术具有两大优点：第一，同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二，可通过对供体细胞的遗传改造，加速家畜品种改良或生产转基因动物。

基因打靶技术：基因打靶技术是一项新兴的分子生物学技术，包括去除致病或不利基因座位的基因敲除技术，以及将目的基因定点整合到基因组特定位点的基因敲入技术。该技术是利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点上，从而改变细胞遗传特性的方法，它的产生是遗传工程领域的一次革命，为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究手段。目前基因打靶技术在研究基因的结构和功能、表达与调控、转基因及基因治疗等方面均取得了进展，但基因打靶技术仍存在一些问题，主要是打靶的效率太低。

胚胎干细胞（ES）介导的转基因技术：胚胎干细胞是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

胚胎干细胞（ES）是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系，在滋养层或条件培养基中具有无限增值能力。从胚泡期胚胎内的细胞群中分离细胞，培养并用外源基因进行转染，外源基因通过随机插入或同源重组的方式整合到ES细胞的基因组中。将转入外源基因的ES细胞重新导入囊胚或进行克隆，可培育转基因个体。这种技术称为胚胎干细胞（ES）介导的转基因技术。

ES细胞被公认为是最理想的受体细胞，是转基因动物、细胞核移植、基因治疗等研究领域的一种新的试验材料，具有广泛应用前景。但ES细胞不易建株，在小鼠上应用比较成功，而在其他大动物上的应用尚处于探索阶段。

转基因技术整体流程包括外源基因的克隆、表达载体构建、受体细胞准备以及基因转移等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术——合成生物学时代。

转基因犬的研究进展及其前景展望

2009年4月23日，英国《新科学家杂志》报道了韩国首尔国立大学李炳春(Byeong-Chun Lee)研究小组通过成纤维细胞克隆技术成功培育出5头转红色荧光基因比格犬，这是世界上第一批转基因实验犬，5头比格犬在紫外光线下都呈现出红色荧光。他们首次利用病毒载体将荧光基因导入成纤维细胞核内，然后将这些成纤维细胞核移植到去核卵细胞内。核移植胚胎经过一周时间的体外培养后植入代孕母犬体内。研究人员将344个晶胚卵细胞植入20头犬体内，最终7头母犬成功怀孕。其后由于早期胚胎死亡及意外导致肺炎死亡。最终共有5头比格犬存活下来，目前它们非常健康。

转基因犬的问世，是动物转基因技术的一项重大突破。犬可以作为人类癌症、失明等一系列疾病的动物模型，可通过对犬的基因序列改良来研究相关遗传病的预防和治疗。科学家认为：转基因实验犬是研究人员更好地理解人类疾病的一种潜在工具。美国列克星敦市肯塔基州立大学的康车民(音译)认为：“这项最新研究将进一步开拓转基因实验犬在人类疾病研究领域中的应用，下一步我们将培育用于治疗人类疾病的转基因实验犬。”美国斯坦福大学遗传学家格雷格-巴什(Greg Barsh)将狗作为人类疾病的研究模型，他声称培育转基因实验犬是一项“重大技术突破”，显示克隆和转基因技术可以广泛地应用于其他哺乳动物。

转基因犬的研究成功，也有利于人类研究犬的生殖机理。美国科学家康车民（音译）希望犬的转基因技术能够排除犬体内特殊雌激素受体的影响，更好地理解犬繁殖时的激素效应。他认为：犬拥有较长的寿命和生殖周期，在进行关于人类生殖的动物基础实验中，犬作为实验体的优势要超过啮齿类动物。这对于科学家们开展相关研究工作非常有用。

另一方面，转基因犬的成功问世具有十分诱人的应用前景。在未来，人们可通过转基因技术实现提高工作犬的某些性能的美好愿望：比如，可以通过转基因技术培育出嗅觉特别灵敏的超级作业犬，根据需要，培育出其它具有特殊本领的作业犬。同时，通过转基因技术可培育出抵抗某些特殊疾病的转基因犬，诸如可抵抗狂犬病感染的转基因犬，可抵抗犬瘟热、犬细小病毒等病毒感染的转基因犬等。随着转基因技术的深入研究和未来的不断发展，还可以根据人们的需要，通过转基因技术培育体大如牛的超大体型犬，也可培育出可放在手掌中玩耍的超小体型的玩具犬，可钻到汽车或飞机“心脏”周围进行安全检查的微型工作犬，通过犬转基因技术改变犬的体形外貌毛色等，培育出符合我们理想的观赏犬。

然而，转基因研究是一项成本高昂，见效缓慢的研究。除了低成功率之外(韩国科学家首次研究中成功率仅1.7%)，摆在研究人员眼前的另一项挑战就是转基因的定点整合问题。李炳春研究小组使用一种逆转录酶病毒将荧光基因植入犬的成纤维细胞，但是他们无法控制这些病毒进入犬的基因组内特定位置。这就很难避免培育出缺少特殊基因或基因变异的转基因犬。

动物转基因技术难题还比较多，目前实验动物（如小鼠，大鼠和兔）的转基因整合率仅为1%，而家畜（如牛、羊和猪）的整合率更低。而且外源基因容易从基因组中消失导致不能连续传代。此外，外源基因表达不理想，同一个体的不同组织、不同个体的同一组织表达水平很不一致。转基因可能给动物造成插入突变和机能紊乱。目前转基因动物成活率很低，到目前为止，国内外的转基因动物几乎有一半在出生后一周内就会死亡，迄今原因不明。另外转基因的产品的安全性也是人们十分关注的一大问题。

（作者单位：公安部南昌警犬基地，330100）

（编辑：李 冰）