PCR法鉴定结核分枝杆菌复合群亚种的研究

汪小黎 崔振玲 王洁 陆俊梅 胡忠义

(1.苏州大学基础医学与生物科学学院 苏州 215123;2.同济大学附属上海市肺科医院上海市结核病(肺)重点实验室 上海 200433)

结核分枝杆菌复合群中各菌型致病性和药物敏感性不尽相同,在临床治疗前需要进行菌种鉴定,目前临床使用的生化方法耗时长,给治疗带来不便,本研究采用PCR法可快速鉴定结核分枝杆菌复合群亚种,具有快速、准确的优点,现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 人结核分枝杆菌标准株(H37Rv,CMCC(B)95053)和牛结核分枝杆菌标准株(CMCC(B)93006),非洲分枝杆菌标准株(M.africanum,CMCC(B)95049)购自国家菌种保存中心。19株牛结核分枝杆菌分离株(M.bovis),PNB培养生长试验阴性,TCH培养生长试验为阴性;20株人结核分枝杆菌分离株(M.tb),PNB培养生长试验阴性,TCH培养生长试验阳性。

1.1.2 试剂 罗氏培养基,参照文献[1]制作;液体培养基为米氏7H9培养基(含10%OADC营养添加剂),购自Difco公司;硝基苯甲酸(PNB)、2-羧酸肼噻吩(TCH)购自sigma公司;基因组抽提裂解液为优化碱裂解法配方,是本实验室自制;引物及探针合成由上海生物工程公司完成;PCR所有试剂购自TAKARA公司;硝酸纤维薄膜,购自Amersharn公司;其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR鉴定法 参照文献[2]针对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、 Rv1970、Rv3877/8、Rv3120设计引物进行PCR扩增。在此基础上,针对M.bovis RD4区缺失的特点,在缺失片段两端设计一对新引物RD4-sense：5′-cccgcactgaccatgccattt-3′,RD4-antisense：5′-cgcaaggacctgttcaccaa-3′,M.bovis扩增后的目的条带为881 bp,M.tb扩增后的目的条带为2801 bp。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2 生物化学方法

1.2.2.1 PNB和TCH试验参照文献[1]操作。

1.2.2.2 TCH的MIC值测定 用液体培养基将TCH倍比稀释至0.0625μg/ml,0.125μg/ml,0.25μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml。MIC 检测方法参照文献[3]。

1.2.2.3 硝酸还原酶实验 按照参考文献[1]操作。

1.2.3 Spoligotyping检测 参考文献[4]操作。

2 结果

2.1 PCR法鉴定结果

2.1.1 7对引物鉴定结果 39株临床分离菌株电泳结果一致(图1d)。

2.1.2 优化PCR鉴定结果 8对引物PCR联合鉴定,39株临床分离菌株电泳结果一致(图2d)。

2.2 生化鉴定结果 生化鉴定结果见表1。

2.3 TCH的MIC检测结果 牛结核标准株MIC值为0.5μg/ml,5株TCH选择培养基阴性临床分离株和H37Rv标准株的MIC值均≥1.0μg/ml。

图1 PCR鉴定结果图

图2 优化PCR鉴定结果图

表1 39株临床分离株及牛结核标准株,H37Rv生化鉴定结果a

表2 Spoligotyping检测结果

2.4 Spoligotyping检测结果 39株临床分离株及H37Rv,牛结核标准株,非洲分枝杆菌标准株Spoligotyping检测结果见表2。

3 讨论

目前临床常用生化方法鉴定结核分枝杆菌复合群的方法存在时间长,无法准确鉴定的缺点,本研究用生化方法检测结果显示重复性差。为此本研究在已有PCR鉴定基础上,进一步改良优化,建立了新的PCR鉴定结核分枝杆菌复合群亚种的方法。

7对引物PCR鉴定结果分析显示39株待检菌株均非M.bovis,与M.tb标准株结果一致。M.tb和M.bovis是结核分枝杆菌复合群中临床最常见的2种,且根据已有报道[5]推测临床标本中不排除2种菌株同时存在的可能,但7对引物联合鉴定法中由于牛结核分枝杆菌无特异特征条带,无法检测出混合菌株中的牛结核菌株。针对此缺陷,本研究根据M.bovis缺失RD4片段的特点,在RD4片段两端设计引物进行PCR扩增。目前Spoligotyping技术已大量应用到结核分枝杆菌复合群亚种鉴定[6-8],本研究Spoligotyping检测结果显示39株待检菌株均非M.bovis,与上述PCR扩增鉴定法结果一致,显示可有效鉴定人牛混合菌株。

我国临床分离的结核分枝杆菌复合群主要为M.tb和M.bovis,本研究结果显示优化后的PCR法可有效鉴定结核分枝杆菌复合群亚种,且与常规生化鉴定方法相比准确性较高,操作简便快捷,具有较好的应用前景。

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