烤烟烘烤过程中微生物的动态变化

宫长荣，程 龙，宋朝鹏，王松锋

（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002；2.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草在生长过程中，有大量的次生代谢产物从根系和叶片排出或渗出体外，这些代谢产物为各种微生物的生长提供了充足的营养，在成熟采收的烟叶表面和体内形成特殊的微环境并存在着大量的微生物。微生物在缩短发酵时间、调控烟叶有害成分（如烟碱、蛋白质、TSNA等）、增进烟叶香气等方面对烟叶品质改善中发挥着重要作用[1]。烟叶调制加工所需时间较短，此期间微生物的活动及其对烟叶品质的影响也较少受到关注，对它们的研究报道较少。国外有研究表明，某些微生物在烘烤过程中对烟叶的腐烂和烟叶有害成分含量的消长等方面有重要影响[2-4]。

不同部位烟叶在不同烘烤时期的优势菌属为最适宜当时营养条件的菌类，生命活动能力比同期的其他菌属高。它们的自养异养所产生的生理生化作用对烟叶品质造成一定影响。本试验通过研究河南汝阳上、中、下三部位烟叶在烘烤过程中微生物的数量及优势种类的变化，探讨烟叶烘烤过程优势微生物资源的可用性，为筛选和开发有利于烘烤过程提高烟叶品质的微生物种群提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2008年7—10月进行，试验材料取自于河南汝阳县。供试烤烟品种为新 NC89，5月 5日移栽，种植行距120 cm，株距50 cm，田间管理按优质烤烟栽培生产技术规范进行。

1.2 试验设计及样品制备

取生长发育正常、成熟采收烟叶。采用河南农业大学设计的电热式温湿自控密集烤烟箱进行常规烘烤。分别于开始烘烤以前及开始后取4次样。即：鲜烟样（成熟采收后烘烤前）；38℃（干球温度38℃结束时，叶片八成黄）；42℃（干球温度42℃结束时，叶片全黄）；48℃（干球温度 48℃结束时，叶片叶筋全黄）。

1.3 微生物的分离及培养

每次随即剪取烟样 100 g，使用高压灭菌后的研钵研碎，加无菌水定容到100 mL三角瓶，按常规稀释平板涂抹法进行微生物的分离和计数，稀释倍数选取 10-2，10-3，10-4，10-5。分离真菌用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、H2O 1 000 mL），使用前加入10%的卡那霉素溶液1 mL/L；分离细菌选取牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.0）。每次3个重复。取每次烟样微生物分离中的最优势菌进行鉴定。

1.4 微生物的鉴定

真菌主要依据真菌鉴定手册、真菌学及植物病原真菌学检索表，进行鉴定。常见的典型真菌，依据菌丝分枝和孢子形态直接鉴定到属，对于不产孢子的真菌，诱导其产生孢子后鉴定。参阅相关文献[5-6]鉴定到属。细菌采用KOH法，革兰氏染色法，常规菌体形态观察[7-8]后，使用法国梅里埃公司的VIEK32全自动细菌鉴定系统，选用快速阳性鉴定卡GNI+（V1316）和快速阴性鉴定卡GPI（V1315）鉴定到属。

2 结 果

2.1 烘烤过程真菌的变化

从表1可以看出，鲜烟样中，烟叶所含真菌数最少的是下部叶，为 0.65×105cfu/g，上部叶真菌量最多，为 0.79×105cfu/g。烘烤开始后，不同部位烟叶真菌含量均呈先下降后上升变化。这可能是由于烘烤从开始至干球38℃烟叶达到八成黄期间，烤箱内的温度低、湿度高，比较适宜细菌生长，烟叶含真菌量缓慢下降。干球38℃后，随着烤房温度上升湿度下降，不同部位烟叶的真菌量均缓慢上升，在干球42℃烟叶达到叶片全黄时达到最高。此时，中部叶真菌量最高，为1.12×105cfu/g，下部叶次之，为 1.07×105cfu/g。随后，烤房温度继续上升湿度继续下降，不同部位烟叶真菌含量呈下降趋势。

表1 烘烤过程不同部位烟叶微生物的含量Table1 Amount of microorganism on flue-cured tobacco leaves during curing process

2.2 烘烤过程细菌的变化

不同部位烟叶在烘烤过程中各时期细菌总量变化情况见表1。结果显示，不同部位的鲜烟叶，下部叶细菌量最多，为2.3×105cfu/g；上部叶细菌量最少为1.01×105cfu/g，这可能是由于上部叶受到阳光直射，下部叶接近地面且湿度较高更适宜细菌繁殖。烘烤过程开始时不同部位烟叶的细菌量均逐渐增多，到干球温度38℃时不同部位烟叶细菌量均达到最大，中部叶含细菌量由鲜烟叶的1.63×105cfu/g升至 3.91×105cfu/g，高于此时期下部叶的2.83×105cfu/g和上部叶的2.98×105cfu/g。干球温度38℃至42℃间不同部位烟叶细菌含量略微下降，其后随烟叶的大量脱水干燥，细菌数量明显下降。到48℃叶片叶筋全黄时期，烟叶细菌量已低于鲜烟叶时细菌量的1～2倍。

2.3 烘烤过程微生物优势菌属的变化

不同部位不同烘烤时期优势菌属鉴定结果见表2。共分离出不同的真菌优势属5种，经鉴定分别属于枝孢霉属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、链格孢属(Alternaria)、镰刀菌属(Fusarium)。其中各时期烟样优势真菌中出现次数最多的优势类群为青霉菌和曲霉菌，其次为枝孢霉菌和链格孢菌。共分离鉴定出不同的细菌优势属11种，分别为柠檬酸杆菌属 (Citrobacter)，曼氏杆菌属（Mannheimia)，棒杆菌属(Corynebacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)，肠杆菌属(Enterobacter)，节杆菌属(Arthrobacter)，不动杆菌属(Acinetobacter），巴斯德氏菌属 (Pasteurella)，泛菌属(Pantoea)，鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)，假单胞菌属(Pseudomonas)。

表2 烟叶烘烤过程中微生物优势菌群的变化Table2 Changes of dominant microorganism during the flue-curing process of tobacco leaves

3 讨 论

下、中、上三个部位的烤烟烟叶在烘烤过程中，烟叶细菌最高含量出现在中部叶 38℃八成黄时期的2.98×105cfu/g。这比张树堂等人研究的最高细菌含量少，原因可能是烤烟烘烤设备、细菌分离培养方法的不同。烘烤过程细菌含量变化规律与Morin研究基本一致[9-10]。鲜烟叶中出现的优势细菌，如柠檬酸杆菌属、曼氏杆菌属，是肠道中通常的栖居菌，常见于水、食物、粪便中，可以推断鲜烟叶叶围微生物的优势菌种类与烟叶生长部位、当地生产环境及管理有一定关系。3个不同部位烟叶烘烤过程中叶围优势微生物的种类不完全相同，这可能与烤前不同部位鲜烟叶带菌种类不相同有关。烘烤过程分离的优势细菌证明，棒杆菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、泛菌属在干球48℃前适宜烤房内环境并能较好的进行自养或异养活动。它们的自养异样所产生的生理生化作用可能对烟叶品质的影响强于其他菌属。

烟草调制是烟叶采收后的一个重要加工环节，其可控性非常强，对利用微生物改进提高烟叶品质非常有利。微生物资源丰富，代谢功能复杂，而且易于培养再生，因此，筛选开发利用对烟草品质有利的微生物具有非常大的前景。本试验分离到的微生物，仅仅是烟叶叶片组织中能在供试培养基上生长的菌株，要明确烘烤过程烟叶叶片组织所有微生物的种类，还有待于进一步的工作并尝试其它分离、培养和鉴定方法。如采用更多种类的培养基、厌氧条件培养或分子生物学鉴定方法等。已鉴定的各种微生物对在烘烤过程中烟叶品质的影响作用也有待于进一步研究。

[1]李梅云.微生物改善烟叶品质研究进展[J].工业微生物，2006，36（3）：43-48.

[2]David M.Peele.Chemical and Biochemical Changes during the Flue-curing of Tobacco[J].Recent Advances in Tobacco Science.1995,21:120-121.

[3]Anna Wienik,Alex Christakopoulos ets.Effect of Air-curing on the Chemical Composition of Tobacco[J].Recent Advances in Tobacco Science.1995(21):48-54.

[4]祝明亮.烟草调制期间微生物研究进展[J].微生物学通报，2008，35（8）：1278-1281.

[5]戴芳澜.真菌的形态和分类[M].北京：科学出版社，1987：233-267.

[6]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京：科学出版社，2001：107-138.

[7]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：349-370.

[8]Buchannan R E,Gibbonr N E.伯杰细菌鉴定手册（第8版）[M].中国科学院微生物研究所翻译组，译.北京：科学出版社，1984：382-533.

[9]张树堂，祝明亮，杨雪彪.烘烤方式及烘烤条件对烤烟烘烤中细菌变化的影响[J].烟草科技，2001（4）：42-43.

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