反相高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的血药浓度

王晓娟，袁 君，陈 艳，岳一涛

（安徽省淮南市第一人民医院，安徽 淮南 232007）

苯巴比妥（phenobarbital，PB）、苯妥英（phenytoin，PT）、卡马西平（carbamazepine，CBZ）都是临床常用的抗癫痫药，常联合应用。患者的药代动力学因个体差异有所不同，且不同厂家、不同剂型的产品吸收率及生物利用度也有显著差异，仅凭经验用药难以达到理想的治疗效果[1]，临床主张个体化给药。因此，笔者建立了一种简便、快速、准确的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，以艾司唑仑为内标，同时测定3种药物的血药浓度。现报道如下。

1 仪器与试药

岛津LG-10ATVP高效液相色谱仪，配SPD-10AVP紫外检测器，N2000色谱工作站；湘仪L600型离心沉淀机，光学读数分析天平（湘仪天平仪器厂）；恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；D1810C型自动双重纯水蒸馏器（上海申胜生物技术有限公司）。苯妥英钠对照品（批号为100210-200401），卡马西平对照品（批号为100142-199503），苯巴比妥对照品（批号为171222-200504），艾司唑仑对照品（批号为1219-0102），均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈、乙醚为色谱纯（美国Tedia公司）；自制重蒸馏水；正常人空白混合血清（本院检验科提供）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：大连依利特C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇 -乙腈 -水 （27.5∶27.5 ∶45）；柱温：30 ℃；检测波长：243 nm；流速：0.8 mL/min；内标物：艾司唑仑；定量环进样：20μL。空白血清、含药血清经本法处理后的色谱图见图1。可见，PB，PT，CBZ及艾司唑仑的保留时间分别为 5.282，7.607，8.340，10.973 min。分离度 R均大于1.5，各色谱峰无重叠、峰形好。地西泮、氨茶碱等其他同服药物同法提取、进样后对结果无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.2 标准贮备液及内标液制备

精密称取105℃恒重的PB，PT，CBZ及艾司唑仑对照品适量，分别置25 mL量瓶中，以甲醇稀释为1000.0，299.8，266.0，534.0μg/mL的标准贮备液及内标液，4℃冷藏保存。

2.3 样品处理

精密吸取艾司唑仑内标液5μL（534.0μg/mL），用N2小心挥干；精确吸取血清200μL，置15 mL具塞尖底玻璃试管中，充分溶解，加5 mL乙醚旋涡振摇3 min，以4000 r/min转速离心5 min，取上清液，置10 mL尖底玻璃离心管中，于45℃水浴、氮气吹干。残渣用100μL流动相溶解，取20μL进样。

2.4 血药浓度测定方法

精确配制含 PB，PT，CBZ 分别为 20.00，14.99，6.65μg/mL 的正常人血清对照品溶液（同时精密加入艾司唑仑内标液5μL），按2.3项下方法处理后进样分析，以此作为定量标准。结果按公式C= （Ai/A内i）/（As/A内s）·Cs计算，式中 Ai和 A内i分别为样品和内标峰面积，As和 A内s分别为对照品和内标峰面积，Cs为对照品质量浓度。

2.5 方法学考察

标准曲线制备：取2.2项下配制的各药物标准贮备液，精密配制成含 PB 为 80.0，40.0，20.0，10.0，5.0，2.5，1.5μg/mL，含 PT为 59.96，29.98，14.99，7.49，3.75，1.87，1.12μg/mL，含 CBZ 为26.60，13.30，6.65，3.32，1.66，0.83，0.50μg/mL 的血清标准液，各7管。按2.3项下方法及色谱条件处理后进样测定。以各药物峰面积与内标峰面积之比（X）对各药血清浓度（Y）进行线性回归。结果见表1。

表1 各药物直线方程与线性范围

萃取回收率试验：取空白血清200μL，准确加入一定量的标准贮备液，配成高、中、低3种质量浓度的血清标准品，并按2.3项下方法处理后进样，以此峰面积与未经提取的相同量对照品峰面积之比计算各药的萃取回收率。结果见表2。

表2 萃取回收率试验结果（，n=3）

表2 萃取回收率试验结果（，n=3）

药物PB药物质量浓度（μg/mL） 对照品595287297331145211414293204440102284952507476280238095峰面积 萃取回收率（%）RSD（%）PT CBZ 40.020.010.044.9722.4511.2413.306.653.32血样583381±12834291087±6986136208±2316398964±11570196058±627499011±2772925837±19442470565±8941234762±539998.097.997.896.395.996.897.298.898.62.22.41.72.93.22.82.11.92.3

方法回收率及精密度试验：取萃取回收率试验项下低、中、高系列质量浓度的标准质控血清样品，按2.3项下方法操作，以当日回归方程计算各药物质量浓度，以加入质量浓度与实测质量浓度之比计算相对回收率。取上述低、中、高3种质量浓度的标准质控血清样品，分别在同日内测定3次和连续3 d每天测定1次，计算日内精密度和日间精密度。结果见表3。

表3 方法回收率及精密度试验结果（，n=3）

表3 方法回收率及精密度试验结果（，n=3）

药物 实测质量浓度（μg/mL）加入质量浓度（μg/mL）精密度RSD（%）方法回收率（%）PB PT CBZ 40.0020.0010.0044.9722.4511.2413.306.653.3238.90±1.1019.63±0.629.81±0.2443.94±1.7222.00±0.8910.99±0.4013.19±0.436.60±0.213.27±0.1097.398.098.097.798.097.899.299.298.5日内2.83.22.43.94.03.63.33.23.0日间3.22.63.13.54.23.92.82.23.4

最低检测质量浓度确定：按信噪比 S/N=3∶1计算，测得PB，PT，CBZ的最低检测质量浓度分别为1.0，0.5，0.2μg/mL。

2.6 临床应用

采用本法测定了以治疗药物监测及中毒监测为目的的80例癫痫患者的血药浓度，均在血药浓度达到稳态后于早上服药前空腹采血进行检测。其中有的患者经剂量调整后，效果明显。典型病例如刘某，女，21岁，癫痫史8余年，联合口服应用苯妥英钠及丙戊酸钠，因出现口齿不清、眼球震颤、共济失调等症状，初步判断为苯妥英钠中毒，监测血药浓度苯妥英钠为11.8μg/mL，丙戊酸钠为55.3μg/mL。分析认为，丙戊酸钠可抑制苯妥英钠的代谢，且竞争蛋白结合，两药同服时苯妥英钠的游离药物代谢减少，可能出现苯妥英钠总质量浓度在有效质量浓度范围内，但游离药物质量浓度却较高，导致了中毒症状。将口服苯妥英钠0.15 g、每日2次调整为0.1 g、每日2次后，症状逐渐缓解，于7 d后重新测定，苯妥英钠血药浓度为8.5μg/mL。出院随访，患者病情稳定。

3 讨论

笔者曾参照文献[2]采用甲醇 -乙腈 -水（45∶10∶45）进行试验，结果峰形不好、回收率低。重新调整三者比例为甲醇-乙腈-水（27.5∶27.5∶45）后，峰形理想、分离效果好、柱效高、回收率均在96%以上，整个过程15 min即可完成。经反复试验发现，选用乙醚作萃取溶剂时，杂质峰少，回收率高，一次萃取即可，且乙醚毒性低、挥发快、易于分离。此方法可以满足快速、准确地检测血药浓度的要求。初步试验显示，该方法同样适用于地西泮、阿普唑仑及氯硝西泮的血药浓度测定。临床治疗癫痫联合应用PT，PB，CBZ比较常见[3]，但三者很少联用艾司唑仑，因此，可采用艾司唑仑为内标物同时测定3种药物的血药浓度。

笔者曾参照文献[4]选用254 nm作检测波长，发现在此波长处PT吸收小。反复试验表明，3种药物在243 nm波长处吸收均最强。色谱图中仅见CBZ吸收峰，未见其活性代谢物（ECBZ）吸收峰，空白血样中杂质对药物及内标峰也无干扰。

为保证检测的血药浓度数据对临床用药有实际指导意义，合适的取样时间是关键。在实验室开展血药浓度监测初期，常有采血时间不当的现象。若临床怀疑中毒，应测定服药后峰浓度或出现中毒症状时采血为宜，疗效不佳时应测定谷浓度。此外，还应注意药物的峰浓度与药物剂型、给药途径等因素有关。因此，解释血药浓度结果时应注意给药途径、末次给药时间和取血时间等相关因素。

血药浓度监测和临床观察很好地结合起来，才会使癫痫患者的药物治疗更安全、有效。由于患者个体差异或年龄、性别以及生理、病理等因素的差别，药物的血浆蛋白结合率有较大的差异，这对PT的影响更复杂。蛋白结合率低可使患者总的血药浓度在正常范围内，但游离药物浓度可能已超过了上限，而药物的疗效和中枢性毒性反应与血液中游离状态的药物浓度密切相关，这在解释血药浓度监测结果时应特别注意。

[1]唐 薇，杨春梅，江秀华，等.216例癫痫患者卡马西平血药浓度监测与合理用药[J]. 中国医院用药评价与分析，2001，1（2）：104-105.

[2]涂厉标，祝永明.HPLC法同时测定人血清中苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的浓度[J]. 中国药师，2005，8（11）：934-936.

[3]唐荣福，于 星.抗癫痫药物联合使用时血药浓度分析[J].医药导报，2007，26（2）：163-164.

[4]王增寿，朱光辉，李光乾.高效液相色谱法测定血清中苯巴比妥、苯妥英、卡马西平与氯硝安定的浓度[J].中国现代应用药学杂志，2002，19（2）：155-156.