肠必清栓对UC模型大鼠肠黏膜内IL-1β、TNF-α及SOD的影响

马建华，郑绘霞，赵玉泽，赵正保

（1.山西医科大学药学院药化教研室，山西太原 030001；2.山西医科大学附属第一医院病理科，山西太原 030001；3.山西医科大学儿科系，山西太原 030001）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统在UC肠道炎症发生、发展、转归过程中始终发挥重要作用。细胞因子参与免疫反应和炎症过程，肠道黏膜免疫系统中促炎性细胞因子与抗感染细胞因子之间的平衡失调所致的免疫异常是UC的重要发病机制[1]，而促炎性细胞因子IL-1和TNF-α是公认的能介导UC发病的细胞因子[2-3]。另外，UC肠黏膜炎症导致的损伤可能是活性氧的作用结果[4]，有研究认为抗感染作用的主要机制是抗脂质过氧化，抗氧化治疗如应用SOD或增强SOD活性均能有效防治结肠黏膜损伤[5]。本实验旨在通过观察新药肠必清栓[6]对UC模型大鼠肠组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、抗氧化反应的酶SOD表达的影响，从细胞因子角度进一步探讨其治疗UC的免疫学机制和抗感染、抗氧化的作用机制，为肠必清栓治疗UC提供一定的实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康 SD大鼠 54只，雌雄各半，体重（200±20）g，购自山西医科大学实验动物中心；柳氮磺吡啶原料由山西三九同达药业有限公司提供；肠必清栓由本实验室自制；IL-1（批号：BA0962200905）、SOD 抗体（批号：BA1401200905），SABC 免疫组化检测试剂（批号：SA2002200905）购自武汉博士德生物工程有限公司；TNF-α 抗体（批号：J1608200904）、PV-9000二步法免疫组化检测试剂（批号：K96712E200904）购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UC模型的建立及分组治疗 用2,4-二硝基氯苯免疫加醋酸局部灌肠法造模后将48只大鼠随机分为五组：模型对照组（A 组，8 只），肠必清栓低、中、高剂量组（B、C、D组，各 10 只），柳氮磺吡啶（SASP）药物对照组（E 组，10 只），另设正常对照组（F组，6只）。A、F组给予等量的不含药物的空白基质，B、C、D 组分别按 160、320、640 mg/（kg·次）给药，E组按300 mg/（kg·次）给药，1次/d。给药2周后将实验大鼠全部处死取结肠组织，中性福尔马林固定，病理切片做免疫组化染色。

1.2.2 细胞因子IL-1β、TNF-α、SOD检测 采用免疫组化法，按试剂盒说明书操作， 其中一抗浓度分别为1∶100、1∶100、1∶200。染色结果以细胞质、胞核出现棕黄色颗粒为阳性。IL-1β、SOD采用BI-2000图像分析系统对染色结果进行定量分析，在400倍视野下选取5个阳性颗粒清晰、无非特异性染色的视野，测定其灰度值；TNF-α参照Fromowitz半定量法计分[7]，阳性细胞率<0.05为0分，0.05～0.25为1分，0.26～0.50为2分，0.51～0.75为3分，>0.75为4分；胞质染色阴性为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，将前两个分数相加，每个标本取5个视野进行评分后取其均值。

1.3 统计学处理

用SPSS 16.0软件进行分析。评分数值应用均数±标准差（）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肠必清栓对UC大鼠结肠组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表达的影响：模型组和给药组大鼠结肠组织中IL-1β、SOD呈弥散性分布，在黏膜上皮均有表达，主要分布于黏膜腺体内及间质炎性细胞胞质；TNF-α在黏膜层间质表达，围绕炎性细胞核呈团块状的胞质表达，模型组见少量胞核着色。模型组大鼠肠组织中IL-1β、TNF-α表达显著增多（P<0.01），而SOD显著减少（P<0.01），给药治疗可明显降低IL-1β、TNF-α的表达；肠必清栓低、中、高剂量组间呈剂量依赖关系，且三组间差异显著，高剂量组与柳氮磺吡啶药物对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）；SOD在模型大鼠肠组织中仅少量表达，给药治疗可提高模型大鼠SOD的表达，肠必清栓中、高剂量组、柳氮磺吡啶药物对照组和正常组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

3 讨论

UC肠道炎症与黏膜免疫系统中细胞因子的失衡和抗氧化系统的失衡有关。细胞因子失衡表现为炎性细胞因子异常增多而抑炎性细胞因子异常减少或相对不足[8-9]。因此，近几年细胞因子成为UC发病与治疗研究中的热点，其中促炎性因子，如 IL-1、TNF-α、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 等，参与细胞免疫反应，与炎症有关；抗炎性细胞因子主要由T细胞产生，如 IL-10、白介素-1 受体拮抗剂（IL-1ra）、IL-4、IL-11、IL-13等，参与体液免疫反应，在维持机体正常免疫系统中起重要作用[10-11]。研究认为，UC中导致组织损伤的急性炎症很大程度上是由TNF-α和IL-1β的强大生物活性造成的[2-3]。

表1 肠必清栓对UC大鼠结肠组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表达的影响（）Tab.1 Effects of Changbiqing Suppository on the expression of IL-1β，TNF-α and SOD in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis()

表1 肠必清栓对UC大鼠结肠组织中细胞因子IL-1β、TNF-α、SOD表达的影响（）Tab.1 Effects of Changbiqing Suppository on the expression of IL-1β，TNF-α and SOD in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis()

与模型对照组比较，a P<0.01；与正常对照组比较，b P<0.01；与肠必清栓低剂量组比较，c P<0.01；与肠必清栓中剂量组比较，d P<0.01Compared with UC model group,a P<0.01;compared with normal control group,b P<0.01;compared with Changbiqing Suppository low dose intervention group,c P<0.01;compared with Changbiqing Suppository moderate dose intervention group,d P<0.01

组别n IL-1βTNF-αSOD模型对照组857.478±4.8005.7±0.1137.430±12.600肠必清栓低剂量组1070.345±6.700ab 4.5±0.2ab 99.915±8.100a肠必清栓中剂量组1097.914±7.500abc 2.8±0.5abc 78.573±6.200ac肠必清栓高剂量组10112.910±10.800abcd 2.3±0.2abcd 77.873±7.000ac柳氮磺吡啶药物对照组10116.770±13.500abcd 2.3±0.2abcd 75.868±6.600ac正常对照组6141.070±21.300a 1.5±0.2a 77.109±4.200ac

IL-1是重要的免疫调节因子和炎症介质，它促进淋巴细胞增殖，分泌细胞因子，参与辅助抗原提呈细胞（APC）激活Th细胞，增强CTL的杀伤肿瘤细胞活性，增强NK细胞的杀伤肿瘤细胞活性，增强巨噬细胞的抗肿瘤作用，引起巨噬细胞趋化和合成 IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2等；能诱导下丘脑血管内皮细胞膜磷脂释放花生四烯酸，还能诱导内皮细胞中环氧化酶（cyclooxygenases）基因表达，促进骨髓释放中性粒细胞诱导单核细胞和多核粒细胞趋化浸润到炎症局部，在局部释放溶酶体酶，还可引起嗜碱粒细胞和肥大细胞脱颗粒，释放炎症介质等[12-13]。

TNF-α主要是由单核-巨噬细胞产生，其生物学活性非常复杂，参与免疫和炎症的调节；可诱导IL-1增加，与IL-2协同促进T细胞产生IFN-γ，增强巨噬细胞的活性，促进免疫应答的能力和杀伤功能，对炎症局部的中性粒细胞的活性和聚集也有促进作用，抑制B细胞增殖和分泌免疫球蛋白，可活化 NF-κB，诱导 IL-1、IL-6、IL-8 和 TNF 等基因转录，促进炎症反应[9,11,13-14]。

近年来一些研究认为机体氧自由基（oxygen free radical，OFR）的形成和抗氧化系统的失衡在UC发病过程中起重要作用[14-15]。刘颖等[15]报道UC患者结肠黏膜中自由基水平明显升高，抗氧化系统存在缺陷；邓莉等[16]用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导大鼠UC模型，潘洋等[17]采用二硝基氯苯和乙酸复合方法制备大鼠UC模型，均观察到大鼠结肠组织中MDA含量显著升高，SOD活性明显下降。这些结果与研究的理论一致，进一步印证了UC患者及模型大鼠结肠黏膜中自由基水平升高而抗氧化系统存在缺陷。SOD和GSH-Px是生物体内氧自由基的天然清除剂。UC患者及模型大鼠肠组织中自由基的大量存在及抗氧化系统缺陷如SOD活性下降等，是造成自身组织损伤的关键，若用抗氧化治疗，清除自由基或提高机体抗氧化酶的活性，能有效防止结肠黏膜损伤；而且，抗氧化剂包括N-乙酰半胱氨酸、SOD、过氧化氢酶、维生素E等可以抑制NF-κB的活化[18]，从而间接抑制了由NF-κB转录的大量炎性细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF的产生，最终起到减轻炎症、保护自身组织损伤的作用。

UC的发病是多因素、多环节相互作用的结果，而细胞因子的作用并不是孤立的，是相互正负调节的复杂网络。本实验中，肠必清栓可显著降低UC模型大鼠肠组织中促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的表达，而上调SOD的表达。通过抑制 IL-1β、TNF-α 的表达， 从而抑制 IL-1β、TNF-α 诱生的IFN-α/β、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 等多种炎性 CK 的生成，抑制TNF-α还能阻断由TNF-α介导的NF-κB的活化，从转录水平减少炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12 等的表达，由此形成级联反应；而SOD活性增强又可进一步抑制炎症及损伤，从而影响细胞因子相互正性或负性调节的网络。肠必清栓下调促炎性细胞因子的表达、增强组织中SOD的活性，在治疗UC中发挥其免疫调节及抗感染、抗氧化作用。

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