上矢状窦闭塞后水通道蛋白 -4表达与血 -脑脊液屏障破坏的关系

张忠玲,李国忠,陈旭辉,尹燕红,宋 宇,赵秀丽

脑静脉窦闭塞后会引起静脉压力升高,细胞间液和脑脊液之间的平衡失调,导致严重威胁患者生命的脑水肿,尤其早期表现为血 -脑脊液屏障 (blood-brain barrier,BBB)破坏引起的血管源性脑水肿,临床缺乏有效的治疗方法。近年来研究发现,广泛分布于星形胶质细胞轴突的水通道蛋白 -4(aquaporin 4,AQP-4)介导水分子的跨膜转运,在脑梗死及脑出血后 AQP-4表达显著增高,参与血管源性脑水肿的形成[1]。而关于脑静脉闭塞的研究少见报道。本研究旨在探讨大鼠上矢状窦闭塞后 AQP-4在 BBB破坏中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型 选择健康雄性 Wistar大鼠 49只,体质量 250～300 g(哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供)。采用随机数字表将大鼠随机分为对照组和实验组,实验组又根据不同闭塞时间 3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d分为 6组,每组 7只,正常饮食 (哈医大一院动物实验中心提供)平衡 1周。参照 Schaller等[2]报道的方法,大鼠腹腔内注射 10%水合氯醛 (350 mg/kg体质量)全麻醉后,固定于立体定向仪上,在无菌条件下行额顶部开颅,骨窗为 0.5 cm×0.5 cm,暴露上矢状窦,在显微镜下沿上矢状窦后段两侧切开硬膜约 0.3 cm,使上矢状窦后段游离,用丝线贯穿后在近窦汇 0.1 cm处结扎上矢状窦后段,术后缝合皮肤,放回笼内,自由喂养。按不同闭塞时间处死大鼠,如实验3 h组于结扎上矢状窦后 3 h处死大鼠,其余各组依次类推。对照组 (假手术组)只暴露、游离上矢状窦,丝线贯穿留置而不结扎。

1.2 脑组织含水量的测定 取各组大鼠 7只,处死后取脑,各组动物取相同部位额部皮质 150 mg,称湿重 (精确到 0.1 mg)后立即放入恒温电烤箱内,温度设置为 100℃,时间为24 h,然后称取干重,用 Blliot公式:脑含水量 =(湿重 -干重)/湿重 ×100%,计算脑组织含水量。

1.3 BBB通透性测定 各组大鼠处死前 1 h尾静脉注入 1.5%伊文氏蓝 (Evan blue,EB)2 ml/kg,麻醉后心内灌注 0.9%氯化钠溶液 200～250 ml,断头取脑,放置于 5 ml甲酰胺中孵育 24 h,收集上清液,用 756分光光度计 (620 nm)测得吸光度,依照 EB/甲酰胺标准品计算出脑组织 EB含量 (μg/g)。1.4 免疫组化检测 AQP-4蛋白的表达 取各组大鼠 7只,0.9%氯化钠溶液经主动脉灌流冲洗血液,再用 4%多聚甲醛200 ml灌注固定,取脑放入 20%蔗糖 PBS液中 4℃过夜脱水,次日,将标本置于恒冷冰冻切片机行冠状连续切片,片厚 6 μm,冰冻切片经 H2O2处理 10 min后,用 10%正常羊血清封闭 30 min,一抗 (浓度为 1∶250)为兔抗大鼠 AQP-4单克隆抗体 (武汉 Boster生物技术公司),室温下孵育过夜,ABC试剂盒 (北京中山公司)按说明书进行操作,DAB显色系统闭光显色后光镜观察,AQP-4蛋白阳性细胞为神经元胞质内有棕黄色沉淀物,计数每平方毫米中阳性细胞数。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。计量资料以 (x±s)表示,采用 t检验和相关性分析,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑组织含水量及 EB含量的比较 脑组织含水量在上矢状窦闭塞 6 h开始增加,持续升高 3 d达到高峰,后逐渐回落,实验 6 h、12 h、24 h、3 d、7 d组与对照组比较,差异均有统计学意义 (P＜0.05)。与对照组相比,实验组脑组织EB含量在 6 h、12 h、24 h、3 d时明显升高,差异均有统计学意义 (P＜0.05),24 h时 EB含量达到高峰 (见表 1)。

2.2 各组 AQP-4表达情况的比较 对照组相同部位可见AQP-4表达呈弱阳性,上矢状窦闭塞后各时相点水肿脑组织均有不同程度 AQP-4阳性表达细胞。AQP-4表达在上矢状窦闭塞后 6 h开始上调,24 h达高峰,维持 3 d时开始逐渐回落,除 3 h外,实验组各时相点相同部位 AQP-4的表达与对照组比较,差异均有统计学意义 (P＜0.05,见表 1)。

2.3 AQP-4表达与脑组织含水量的相关性分析表明,两者呈正相关 (r=0.846,P＜0.01)。

表 1 对照组与实验组大鼠脑组织含水量和 EB含量及 AQP-4表达情况比较 (x±s)Table 1 Comparison of brain water content,concentration of EB,AQP-4 expression between control group and test groups

3 讨论

脑水肿是脑静脉窦闭塞后最主要的病理变化,脑静脉窦闭塞后脑水肿的形成是一个十分复杂的过程,目前的研究还远不能清楚地阐明。血管源性脑水肿是由于 BBB开放或破坏、血管通透性增加导致血浆蛋白、水分和电解质等向血管外渗出引起的细胞间质水肿,是脑静脉窦闭塞后早期的病理生理特征[3]。以往研究发现,AQP-4在与毛细血管和软脑膜直接接触的神经胶质细胞及血管周围表达丰富,这些分布特点表明AQP-4是 BBB水调节和运输的重要结构,与 BBB的通透性有密切关系[4]。

本研究结果显示,上矢状窦闭塞后 3 h脑组织含水量即有增加的趋势,实验6 h组与对照组比较有差异,而代表 BBB损伤的 EB含量与 AQP-4表达的增加均在上矢状窦闭塞后 6 h,这提示上矢状窦闭塞后极早期 (6 h以内)脑组织含水量的增加可能与 AQP-4表达及 BBB的改变无关,而是由于静脉侧支通路的开放,静脉压升高,脑脊液回流受阻,导致颅内压升高,从而引起脑组织含水量的增加,是一种流体静力性脑水肿。上矢状窦闭塞后 24 h,EB含量与 AQP-4表达达到最高峰,脑组织含水量也明显增加,说明 AQP-4的增高与 BBB的破坏有直接关系,是血管源性脑水肿形成的关键机制。相关性分析表明 AQP-4表达与脑组织含水量呈正相关。但是,上矢状窦闭塞后脑组织含水量在第 3 d达到高峰,与 AQP-4表达的高峰并不一致,说明还有其他的机制参与脑水肿的形成,我们推测随着上矢状窦闭塞时间的延长,动脉血流减慢,局部脑血流量减少,脑组织缺血、缺氧,能量代谢衰竭,细胞膜破坏,离子和水分子进入细胞内,导致细胞毒性脑水肿,使脑水肿进一步加重,这符合脑静脉梗死的病理生理特点,即早期出现血管源性脑水肿,随后出现细胞毒性脑水肿[3]。

由此可见,AQP-4增高是 BBB的破坏及血管源性脑水肿的重要因素,抑制 AQP-4的表达将达到缓解脑水肿的目的。有研究发现,脑缺血再灌注后,激活的蛋白激酶 C(PKC)可以使 AQP-4磷酸化,磷酸化后的 AQP-4生物活性丧失,从而减轻脑水肿,但是 PKC的激活也可以直接引起 BBB的通透性增加,加重脑水肿[5],因此推测,机体可能存在一套调节AQP-4与 PKC之间平衡的机制,有必要进一步深入研究。总之,本研究结果提示,上矢状窦闭塞后 AQP-4表达增高是 BBB破坏的原因之一,如果能在早期抑制 AQP-4的表达,可能会保护 BBB和减轻血管源性脑水肿。

1 Badaut J,Lasbennes F,Magistretti PJ,et al.Aquaporins in brain:distribution,physiology,and pathophysiology[J].J Cereb Blood Flow Metab,2002,22:367-378.

2 Schaller B,Graf R,Sanada Y,et al.Hemodynamic changesafter occlusion of the posterior superior sagittal sinus:an experimental PET-study in rat[J].AJNR,2003,24:1876-1880.

3 Rottger C,Trittmacher S,Gerriets T,et al.Reversible MR imaging abnormalities following cerebral venous thrombosis[J].Am J Neuroradiol,2005,26:607-613.

4 唐宇平,蔡定芳,刘军,等 .急性脑出血血肿周围组织水通道蛋白 -4表达与血脑屏障损伤的关系 [J].中华神经科杂志,2005,38(11):704-707.

5 Verkman AS,Binder DK,Bloch O,et al.Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758:1085-1093.