丁苯酞对血管性痴呆大鼠认知功能、海马神经元结构及nNOS的影响

孙玉华 卢 宏

1)河南大学淮河医院神经内科 开封 475000 2)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052

丁苯酞,其活性成分为dl-3-正丁基苯酞,其左旋体存在于芹菜籽中[1]。多年的动物实验研究证明,丁苯酞对缺血性卒中具有较好的治疗作用[2]。丁苯酞能否治疗血管性痴呆给人们提出了新思路。根据文献报道,大鼠双侧颈总动脉结扎后能造成大鼠明显的学习记忆障碍[3],本实验通过建立VD动物模型,应用水迷宫、透射电镜及免疫组化方法对各组大鼠学习记忆、神经元结构、nNOS表达进行观察,探讨丁苯酞对VD的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 动物:均选用 14～15月龄的健康SD大鼠100只,体质量450～550 g,由河南省实验动物中心提供。

1.1.2 药物及试剂:丁苯酞:批号:050106。nNOS多克隆抗体和SP试剂盒来自博士德公司。

1.2动物模型的建立及分组与给药

1.2.1 动物模型的建立:根据Olsson方法[4]结扎双侧颈总动脉。假手术组分离但不结扎颈总动脉。

1.2.2 动物分组与给药方法:将造模成功的VD大鼠随机分为模型组(MDG)、丁苯酞高剂量组(DBT1)及丁苯酞低剂量组(DBT2),加上假手术组(SOG)及丁苯酞预防组(DBT3)共5组。DBT1及DBT2组造模后第61天开始治疗,分别灌服丁苯酞12 mg/100 g/d、6 mg/100 g/d;MDG和SOG以等量消毒花生油灌胃;DBT3组术前30天灌服丁苯酞8 mg/100 g/d;各组均每日1次给药,连续给药30 d。

1.3痴呆标准以假手术组大鼠逃避潜伏期的平均值作为参考值,计算结扎大鼠逃避潜伏期的平均值与参考值之差占该鼠逃避潜伏期的比值,若该值大于20%为痴呆鼠。

1.4观察指标

1.4.1 大鼠学习记忆能力的测定:参照 Morris水迷宫[5]行定位航行实验及空间搜索实验术后61 d按上述方法进行学习记忆测试,按痴呆标准判定VD模型。治疗后第31天再进行水迷宫测试。

1.4.2 电镜标本的制备:大鼠断头处死后,参照大鼠脑图谱,迅速切取右侧海马区组织块,迅速放入预冷4℃的4%的戊二醛中固定,常规脱水、Epon812环氧树脂包埋,LKB超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,日立H-7500型透射电镜观察。

1.4.3 免疫组化染色:按常规操作进行。

1.5定量分析计数在海马区选择3个相邻视野,在400倍光镜下作免疫反应阳性神经元计数,结果取3个视野的平均值。

1.6统计学处理数据以均数±标准差(s)表示,然后运用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),多个样本均数的两两比较用q检验法。α=0.05为检验水准。

2 实验结果

2.1各组大鼠水迷宫实验学习记忆成绩比较表1。

2.2透射电镜观察假手术组可见神经元细胞器结构正常;模型组可见神经细胞高度水肿,细胞核变性,线粒体肿胀,嵴的双层膜结构不清、断裂、萎缩,正常线粒体少见;粗面内质网严重脱颗粒。大剂量丁苯酞组镜下观察神经元正常或轻度异常,可见次级溶酶体,线粒体,高尔基体神经细胞线粒体嵴清晰,正常线粒体多见;小剂量丁苯酞组及预防组可减轻神经细胞变性及线粒体等细胞器的异常变化。

表1 各组大鼠逃避潜伏期及跨平台次数比较

2.3各组海马nNOS阳性细胞表达的比较表2。

表2 各组海马nNOS及SS阳性细胞表达的比较

3 讨论

本实验大鼠的逃避潜伏期及跨平台次数变化提示模型组大鼠发生学习记忆障碍,电镜提示模型组大鼠发生细胞变性水肿,不同剂量丁苯酞治疗后大鼠学习记忆改善,细胞变性水肿减轻。这与以往研究[6]丁苯酞改善脑缺血状态一致。

人们发现了海马突触传递的长时程增强(long term potential,LTP)现象,这种突触传递的可塑性变化与学习记忆如此相似,使得人们自然把海马作为研究学习记忆的首选靶位。研究表明,一氧化氮(nitric oxide,NO)很可能就是 LTP得以产生的关键信使[7],用多种离体或在体实验手段干扰大鼠海马区NO的水平,都会使LTP和学习记忆能力受到影响[8],由此反推,痴呆时海马区NO的水平会有所变化。因为NO的生物半衰期极短,常用NOS的表达表示NO的活性[9]。脑内NOS至少有三型[10]:神经元型NOS(nNOS)、诱导型NOS(iNOS)和内皮型 NOS(eNOS)。Huang等[11]确定了nNOS的神经毒性作用。本实验显示,慢性缺血各组大鼠nNOS表达的阳性细胞数均有不同程度升高,这与王金兰的研究不一致。丁苯酞治疗可明显对抗慢性脑缺血时nNOS活性的升高,减轻其神经毒性作用。

至于丁苯酞的作用机制,可能十分复杂,丁苯酞抑制大鼠脑组织中nNOS的过度表达,减轻细胞变性水肿,可能是丁苯酞治疗VD的神经生化基础之一。

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