血小板膜糖蛋白Ⅰbα VNTR基因多态性与脑梗死的相关性研究

李湘青 翟凤英

山东淄博市中心医院 1)神经内科 2)高压氧科 淄博 255006

血小板在缺血性脑血管病的发展中起重要作用[1]。血小板膜糖蛋白(GP)是一种存在于血小板质膜表面的糖蛋白,在血小板活化和血栓形成过程中起关键作用。GPⅠbα复合物受体是切变应力依赖性受体[2-3],在动脉系统中,整体血流切变应力较高,尤其在粥样硬化斑块或血管痉挛所致的狭窄动脉中,血流切变应力可成倍地增加,高切变应力使GPIbα复合物与vWF结合始动血小板的聚集、活化。继而改变GPⅡb/Ⅲα受体结构,使其激活,形成血小板血栓。因此,GPⅠbα复合物在高切变应力条件下血小板血栓形成和动脉硬化进展中起重要作用[4],本研究为可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeat,VNTR)多态性[5],即编码其巨糖肽区域的DNA序列中有39个碱基在不同的等位基因重复的数目不同,产生 A、B、C、D四种等位基因。多态重复序列可以使GPⅠbα复合物与vWF结合位点延伸,影响GPⅠb复合物与vWF的亲和力,进而影响血栓性疾病的易患性[6]。逐渐增加的证据[7-8]表明某些基因因素能影响止血平衡和血栓形成的危险性。本研究的目的是探讨GPⅠb基因α链VNT R与脑梗死的相关性。

1 对象和方法

1.1对象本文共收集105例脑梗死患者,同时收集100例年龄与性别相匹配的正常人或其他疾病住院的患者作为对照。病例组均行头颅M RI和(或)CT扫描明确诊断,符合1996年第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准,并排除脑出血和占位性病变。对照组均无缺血性脑血管病或冠心病史。各组年龄均＞45岁,排除青年性卒中。所有研究对象均行血糖、血脂等检查。高血压病的诊断标准为Bp≥140/90 mmHg或正服用降压药物;糖尿病的标准为空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降糖药物;吸烟的标准为正在吸烟或有吸烟史;高血脂的标准为血中胆固醇≥5.62 mmol/L或(和)甘油三脂≥1.92 mmol/L或服用降血脂药物。

1.2方法

1.2.1 提取基因组DNA:静脉抽取空腹血 1 mL,加20 μ L EDTA抗凝,4℃冰箱短期存放。采用北京百盛公司生产的UltraPureTM基因组DNA提纯试剂盒,提取的基因组DNA置于-20℃保存。

1.2.2 血小板GpⅠα基因VNTR多态性分析:引物序列参照文献设计合成:正义链5-CAC TAC TGA ACC AAC CCC AAG-3,反义链5-TTG TGG CAG ACA CCA GGA TGG-3,由上海生工生物技术有限公司合成。反应体积:25 μ L,含模板 DNA2 μ L,dNTPs(200 mM)0.5 μ L,引物各 0.3 μ M,MgCl 1.5 mM,10×Buffer 2.5 μ L,Taq聚合酶1.5 U。 Taq酶和dNTP由华美生物工程公司生产。

1.2.3 PCR反应条件:预变性 95℃4 min;95℃变性45 s,60℃退火1 min,72℃延伸 1 min,扩增 38个循环;最后 72℃延伸8 min。吸取 PCR产物10 μ L,在封口膜上和上样缓冲液2 μ l充分混匀,0.1%溴化乙锭染色,依次加入2%琼脂糖凝胶的加样孔中;吸取 DNAMarker 12 μ L(华美生物工程公司的Pgem-7Zf(+)HaeⅢMarker)加入一侧的加样孔中,在1×TBE缓冲液中电泳40 min,电压80 V。放入紫外分析装置中,检测PCR产物的片段大小。

1.3统计学方法采用SPSS 11.0统计软件对资料进行统计分析。年龄比较用t检验,性别、高血压、糖尿病、高血脂以及吸烟比较用χ2检验。基因型和等位基因频率的差异用χ2检验或有关校正方法,P＜0.05者计算相应的OR值和95%CI。按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性。用Logistic多元回归分析来控制其他混淆变量的影响。

2 结果

2.1脑梗死组和对照组的临床特征比较105例脑梗死患者和100例对照之间年龄、性别构成没有差别。脑梗死组高血压、糖尿病、高血脂或吸烟的百分比均显著高于对照组(表1),与目前公认的结论一致,这些情况都是脑梗死的危险因素。

表1 脑梗死组和对照组的临床特征比较

2.2血小板GpIbα VNTR多态性电泳结果PCR扩增产物电泳出现3种DNA片段,195 bp的一个重复片段,234 bp的2次重复片段和273 bp的3次重复片段,312 bp的4次重复序列片段在本实验中未发现,仅有195 bp带型的为DD纯合子基因型,仅有234 bp带型的为CC纯合子基因型。同时发现有195 bp和234 bp带型的DC基因型、195 bp和273 bp带型的DB基因型、234 bp和273 bp带型的BC三种杂合基因型(图1)。

图1 GPIbα VNTR多态性电泳结果

2.3 GPIbα VNTR多态性的分布情况多态性各种基因型和等位基因的频率分布见表 2。DD、CC、CD、BD、BC基因型的频率在脑梗死组分别为 0.15、0.38、0.35、0.048、0.067,在对照组分别为 0.04、0.57、0.37、0.01、0.01。B、C、D 等位基因的频率在脑梗死组分别为 0.057、0.59、0.35,在对照组分别为0.01、0.76、0.225。脑梗死组与对照组经 Hardy-Weinberg平衡定律检验为遗传平衡群体(P＞0.05)。BC、CC、DD基因型2组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。计算BC基因型的比数比OR=7.071,表明BC基因型是缺血性脑血管病的可能致病危险因素,95%CI(0.85～58.55)(见表2)。通过基因型分布计算B、C、D等位基因频率,差异有统计学意义,P=0.001。计算比数比OR=3.98,说明B等位基因具有致病危险性(见表3)。我们对105例脑梗死病人及100例对照人群进行GPIbα VNTR多态性基因检测,未发现 A、B等位基因纯合子及AB、AC、AD杂合子基因型,与德国白人、美国白人不同,即A等位基因表达低,C、D等位基因表达高。

表2 脑梗死组和对照组各基因型分布比较

表3 缺血性脑血管病组和对照组等位基因频率

2.4危险因素独立性分析由于高血压、糖尿病及吸烟等因素在脑梗死组和对照组之间均有显著性差别,为了排除这些因素对基因型的影响,以缺血性脑血管病为因变量,以高血压、高脂血症、糖尿病、GPⅠb B(+)等位基因为自变量,作Logistic回归分析,结果显示B(+)等位基因是缺血性脑血管病发病的一个独立危险因素,OR=5.104,P=0.046,95%CI为0.96～27.147。

3 讨论

血小板是构成动脉血栓的重要成分之一,血小板的粘附、聚集功能是通过血小板膜糖蛋白(GP)来完成的。GPIbα胞外区球状N-末端含有vWF和凝血酶结合位点以及粘蛋白样区称为巨球肽,第一个被确定的多态性为编码巨球肽区域的39 bpVNTR,在人群中存在四种等位基因,按分子量由小到大被命名为D、C、B、A,每个重复序列导致蛋白增加 13个氨基酸,使得vWF结合区远离血小板膜,这种结构的变化将分子暴露于更大的剪切力,导致剪切力诱导的vWF和GPⅠbα相互作用的阈值降低。血小板黏附增强,活化程度异常增高,则可促进动脉粥样硬化的进程,并始动病理性的血栓形成,参与动脉血栓性疾病的发生和发展,给机体造成严重的危害[9]。在粥样硬化斑块阻塞或血管痉挛造成的狭窄动脉中,血流切变应力成倍地增加,高切变应力可诱导vWF的构型发生改变,多聚体形式的vWF与多个GPIb分子以多价方式形成牢固的结合,vWF与GPⅠb间的相互作用不仅导致血小板与内皮组织发生接触黏附,当vWF与GPⅠb复合物结合后,使血小板活化,启动血小板跨膜钙内流,GPⅡb/Ⅲa受体部位暴露,构象改变,介导血小板黏附聚集,最终导致血小板血栓形成。因此,GPⅠb复合物在高切变应力下血小板血栓形成和动脉硬化进展中起重要作用,其分子数增高为血小板黏附性增高的重要原因,促成血栓前状态。动物实验也表明[10],血小板与血管壁相互作用受阻可减少动脉粥样硬化的发生,GPⅠb阻滞剂可阻止或延缓冠状动脉闭塞的发生。因此研究探讨GPⅠbα基因多态性与缺血性脑血管病的相关性,将为缺血性脑血管病的早期检测和防治提供分子遗传学依据。

诸多资料表明[11-12]不同地区、不同种族的人群中,VNTR多态性的基因型分布有差别。高加索人CC最多,占64.75%,日本人 CD最多,占40.46%,白种人中 A等位基因很少表达,B等位基因频率较高,A等位基因在日本人常见,两者均以C等位基因频率最高。本研究结果显示本地区人群A等位基因无表达,而C、D等位基因表达较高,分别为67.54%、27.4%。基因型分布以 CC最多,占 53.17%,CD基因型次之,占35.6%,与我国学者[13]研究结果相似。此结果还有待于扩大样本量进一步研究。

越来越多的研究表明GPⅠbα VNTR基因多态性与血栓性疾病的发生、发展密切相关[14]。目前研究较多的是其与冠心病的相关性[15]。Baker[16-17]等发现 GPⅠb αVNT R B等位基因与急性缺血性脑血管病有关,最近西班牙学者[18]研究了阿司匹林治疗失败(A TF)的再发卒中的基因因素,结论是BC基因型是预测卒中后阿司匹林治疗再发卒中的独立因素。而有些研究[19]发现缺血性中风与GPⅠb αVNTR等位基因无相关性。这些不一致的结果可能与缺乏较好的临床研究标准有关。本研究发现,缺血性脑血管病组BC基因型的分布频率为 6.7%,较对照组明显增高(1%),χ2=4.386,P=0.036。B等位基因频率在缺血性脑血管病组也明显偏高为5.7%,对照组为1%,χ2=5.162,P=0.023。统计学差异均有显著性。通过对各种危险因素的统计分析(χ2检验)发现高血压、糖尿病、高脂血症及B等位基因2组间比较均有显著性差异(P值0.05),应用Logistic回归分析,说明高血压、吸烟、B等位基因可能是脑梗死的发病危险因素。因此,人群中GPⅠbαVNTR多态性与缺血性脑血管病有相关性。B等位基因和BC基因型可能是脑梗死的致病危险因素。目前仍需要大量的前瞻性的基因及流行病学研究阐明GPⅠbα每个基因多态性的作用及其他血小板受体多态性的作用以及这些因素联合作用的协同效应。

缺血性脑血管病是一多因素疾病,大多数为遗传与环境因素联合所致,危险基因的探寻有助于早期发现易患人群,进行重点防治。目前抗血小板治疗在治疗和预防中风中广泛应用,如阿司匹林、噻氯匹啶等,但疗效不甚满意。随着血小板膜糖蛋白分子生物学研究的深入及血栓形成分子机制的阐明,新的血小板膜受体拮抗剂的合成将会取代或补充阿司匹林的作用。现已合成的GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂有TP9201、MK383、integrelin、阿昔单抗等,大规模的临床实验也对GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂的疗效给予了充分肯定[20],阿司匹林抑制环氧化酶,能一定程度上阻止血小板的聚集和释放反应,但不能阻断高切变应力诱导的血小板聚集,噻氯匹啶和GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂均能较好地阻断血小板的聚集,特别是GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂阻断血小板聚集的共同通路,能有效地抑制高切变应力诱导的血小板聚集,但不能有效地抑制血小板释放反应,通过GPⅠb研究,针对GPⅠb复合物及vWF的抗血小板药物的研制,可望受到良好的临床疗效。

通过本研究,我们对本地区人群GPⅠbα(VNTR)基因多态性分布特点及其与缺血性脑血管病相关性作出了初步的探索,获得了初步的结论,但仍需进一步扩大样本,尝试多种实验方法,以获得更确切的结论。

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