白芍总苷对 CIA大鼠血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10及关节浸液 NO和 PGE2影响的研究*

李宜川 张玉霞 刘国玲 高明灿 常景芝 沈永杰 陈晓琦

河南商丘医学高等专科学校生物化学教研室(商丘 476100)

类风湿性关节炎(Rheumation Arth ritis,RA)是以关节滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病,其显著的病变以滑膜组织炎性细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳形成和软骨及软骨下骨质破坏为主要病理表现。RA的发病机制涉及细胞因子、遗传、感染等多种因素,其中细胞因子网络失衡在 RA的发生、炎症迁延、关节的破坏中占有重要的地位[1]。白芍总苷(total glucosides of paeonia,TGP)是从亳白芍干燥根中提取的有效成分,主要为糖苷类物质,具有多途径抑制自身免疫反应,以及抗炎、止痛、抗应激等作用。本实验在成功地建立胶原性关节炎(co llagen-in-duced arth ritis,CIA)大鼠模型的基础上,观察 TGP对 CIA大鼠的治疗作用,通过检测大鼠血清中LI-1β、 TN F-α、IL-4和 IL-10水平及关节浸液中 NO和 PGE2含量,探讨 TGP对 CIA大鼠治疗的可能机制,为临床使用TGP治疗 RA提供新的实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料 TGP:购于安徽医科大学临床药理研究所;弗氏完全佐剂、鸡Ⅱ型胶原(chicken type II collagen,C II):上海本草生物医学工程所提供;多聚赖氨酸:Sigma公司;地塞米松盐酸注射液 (5mg/m L):河南确山龙渊药家庄四药股份有限公司;LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10试剂盒 RD公司;NO试剂盒:南京建成生物工程研究所;PGE2试剂盒、:解放军总医院科技开发中心放免所;酶标免疫测定仪:Bio-Rad公司;80-2型离心机:苏州威尔实验用品有限公司。

Sp rague-Daw ley(SD)大鼠 60只 ,雌雄各半 ,质量 (180±20)g左右,动物中心提供,合格证号:2010A01。

1.2 方 法 1.2.1 实验动物分组:实验用大鼠按统计学方法随机分为 6组:A正常组对照组,B模型对照组,C地塞米松组(2mg/kg),D白芍总苷小剂量组(25mg/kg),F白芍总苷中剂量组(50mg/kg),E白芍总苷大剂量组(100mg/kg)。每组 10只。

1.2.2 CIA大鼠模型的制作及给药方法:将鸡Ⅱ型胶原15mg制成稳定的乳化剂 15m L,每 m L含 1.0gⅡ型胶原,置4℃冰箱保存备用。SD大鼠,除正常对照组外,以 0.1m L/只的剂量在鼠的左后肢足跖皮内注射胶原乳剂致炎,第 7d在大鼠尾、背多点皮内注射 0.1m L该胶原乳剂作为激发注射。正常对照组注射等剂量生理盐水作为致炎物质。于造模后第 7～27d各用药组灌胃给药,1次 /d,正常对照组和模型组用等容积生理盐水灌胃。

1.2.3 血清细胞因子测定:实验第 36d向 CIA大鼠腹腔内注射 3%巴比妥那 0.3～ 0.4m L使之麻醉。剪开大鼠腹腔,心脏取血,3000rpm离心 15m in,吸取上层血清。用 ELISA法 (按试剂盒说明书进行操作)测定 CIA大鼠血清中 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10含量。

1.2.4 关节浸液 NO和 PGE2的测定:大鼠处死后,迅速在左足摘取肿胀足爪,纵向切开足爪组织,放入冷生理盐水中,于 4℃浸泡过夜,离心取上清液过滤除菌。NO含量的测定采用硝酸还原法,PGE2含量测定采用放免法,均按试剂盒说明进行操作。

1.2.5 统计学方法:数据分析用 SPSS11.5软件处理,数据以 x-±s表示,计量资料的组间显著性检验采用单因素方差分析。

2 结 果 2.1 TGP治疗前 CIA大鼠各组血清 LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10水平比较造模后,TGP给药治疗之前,CIA大鼠血清 LI-1β、TNF-α水平较正常组大鼠异常增高(P＜0.01),IL-4和 IL-10含量有所下降,但与正常组大鼠比较无显著性差异(P＞ 0.05),见表1。

表1 治疗前 CIA各组大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比较,(pg/m L,n=10±s)

表1 治疗前 CIA各组大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比较,(pg/m L,n=10±s)

注:各组与正常组比较,△P＜0.01。

正常对照组13.28± 3.4514.21± 6.529.20± 0.7932.86± 6.11模型对照组33.16±4.12△32.98± 6.87△7.73±1.1231.10±4.12 2mg/kg的地塞米松组32.65±4.10△32.58± 3.46△8.30±1.8830.43±1.52 25mg/kg白芍总苷组33.89±5.13△33.19± 1.87△8.41±1.4430.63±3.89 50mg/kg白芍总苷组31.73±4.37△33.15± 4.89△7.76±1.8931.47±2.86 100mg/kg白芍总苷组33.13±3.98△32.88± 1.15△7.69±2.1030.88±3.12

表2 TGP治疗后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平与 CIA对照组的比较,(pg/m L,n=10,±s)

表2 TGP治疗后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平与 CIA对照组的比较,(pg/m L,n=10,±s)

注:与模型组比较,△P＜0.01。

组 别LI-1βTNF-αIL-4IL-10模型对照组34.28± 5.7631.78± 4.737.51.± 1.7824.12± 3.57 2mg/kg的地塞米松组22.48±3.16△22.43± 5.44△33.12±2.10△49.88±8.45△25mg/kg白芍总苷组33.49± 4.8830.10± 2.118.48± 4.3425.44± 6.87 50mg/kg白芍总苷组24.36±5.66△23.62± 4.23△33.22±3.18△50.22±2.78△100mg/kg白芍总苷组23.39±4.32△25.46± 1.53△32.20±2.33△51.41±2.43△

2.2 TGP治疗后血清 LI-1β、 TN F-α、 IL-4和 IL-10水平与 CIA大鼠对照组的比较 TGP(50,100mg◦ kg-1)组及地塞米松(2mg◦ kg-1)组治疗后 CIA大鼠血清 LI-1β和TN F-α水平明显降低,IL-4和 IL-10水平明显上升,与 CIA大鼠模型组比较均有显著性差异(P＜0.01),见表2。

2.3 TGP对 CIA大鼠关节浸液内 NO和 PGF2含量的影响 与正常组比较模型组大鼠关节浸液中 NO和 PGE2含量明显增高 (P＜0.01);TGP(50,100mg◦ kg-1)组、地塞米松(2mg◦ kg-1)组和 TGP(25mg◦ kg-1)组治疗后关节浸液内NO、PGE2含量下降,与模型组大鼠比较有显著性差异 (P＜0.01,P ＜ 0.05)。 见表3。

表3 白芍总苷对 CIA大鼠关节浸液内 NO和PGF2含量的影响,(n=10,±s)

表3 白芍总苷对 CIA大鼠关节浸液内 NO和PGF2含量的影响,(n=10,±s)

注:与正常组比较 ,△P＜0.01;与模型组比较▲P＜0.01,◇P ＜0.05。

正常对照组19.88±8.598.87± 6.46模型对照组47.25±7.22△32.77±9.88△2mg/kg的地塞米松组30.12± 11.46▲15.13±2.16▲25mg/kg白芍总苷组37.22± 12.10◇20.11±1.16◇50mg/kg白芍总苷组28.42± 11.31▲15.66±3.44▲100mg/kg白芍总苷组26.88±2.19▲14.18±6.23▲

讨 论 RA病因和病理机制还不十分明确,但越来越多的证据表明,细胞因子在 RA的病理过程中发挥着重要作用[2]。TN F-α是由 Mф衍生的细胞因子,具有多种促炎作用,在滑膜细胞培养液中 TNF-α可刺激胶原酶和前列腺素 E的产生,导致软骨和骨骼损害[3],TN F-α还能上调粘附分子在血管内皮细胞的表达和其它炎性细胞因子如 LI-1β、LI-6和 GM-CSF等的产生[4]。 IL-1β可诱导 RA关节滑膜细胞增殖,刺激滑膜细胞产生蛋白激酶,增强 TN F-α和 IL-6的效应。 IL-10是一种天然的免疫抑制剂,可减少致病性促炎性细胞因子和趋化因子,抑制LI-1β和 TN F-α的产生,IL-10还能够抑制基质金属蛋白酶的表达及提高金属蛋白酶组织抑制因子的表达,从而产生对软骨细胞的保护作用。 IL-4由 T细胞衍生,可阻碍破骨细胞前体转化为破骨细胞,降低破骨细胞活力,抑制其存活。本实验结果证实,CIA大鼠血液 LI-1β、TN F-α水平升高,TGP治疗后血液LI-1β和 TNF-α含量均明显下降,水平低下的 IL-4和 IL-10含量侧明显升高,提示 TGP可能通过直接或间接作用降低 LI-1β和 TNF-α的产生 ,提高血液 L-4和 IL-10含量,从而对 CIA大鼠发挥治疗作用。

RA动物实验性关节炎时 ,体内 NO水平异常升高,特别是关节浸液中有大量 NO[5]。作为一种重要炎症介质 NO损害关节的机制是促进 PGE2、LI-1β和 TN F-α等炎症介质的释放,导致血管过度扩张、渗出增多[6]。本实验研究发现 CIA大鼠关节浸液中 NO和 PGE2含量明显增高;TGP治疗后 CIA大鼠关节浸液中 NO和 PGE2水平显著低下。提示 TGP可通过抑制关节浸液 NO和 PGE2产生,减轻局部炎症,改善关节肿胀等症状。

综上所述,TGP对 CIA大鼠的多发性关节炎其机制可能是 TGP抑制 CIA大鼠内源性细胞因子 (LI-1β和 TN F-α)活性和炎症局部区域相关炎症介质(NO和 PGE2)产生,同时提高抑炎细胞因子(L-4和 IL-10)含量,诱导炎性细胞因子网络趋于平衡,从而对 CIA大鼠发挥治疗作用。

[1] M arc Feldmmm.Role o f cy tokines in rheumatoid arthritis[J].Ann.Rev.Immunol,1996,14:397.

[2] Arend W P,Dayer JM.Inhibition of the produc tion and effects of Interleukin-1 and tumor necrosis factor a in meumatoid arthritis[J].Arth ritis Rhetum 1995,38:151-160.

[3] Feldmam M,Breman FM.,Maini RN.Role of cytokimes in rheumatoid arthritis[J].Ann Rev Immunol,1996,21:2575-2579.

[4] 吕丽萍 ,张永忠.雷公藤内酯酮对大鼠类风湿性关节炎的影响[J].中成药,2007,29(7):966-968.

[5] 王 斌,陈敏珠.一氧化氮与炎症性关节疾病 [J].中华风湿病学杂志,1999;3(3):191.

[6] Xia LJ,ChenF H,RenB,et a1.Efect of recombinant human endostatin on pro liferation and cy tokines produc tion of synoviocytes from adjuvant arthritis rats in vivo[J].Chin Pharmao～l Bu ll,2007,23(1):59-63.