川芎嗪注射液抑制子宫内膜异位症微血管密度的实验研究

孙盛梅,吴雅冬,周德娟

(佳木斯大学附属第一医院妇产科,黑龙江 佳木斯 154003)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄期妇女的常见病和多发病,近年来发病率呈上升趋势,这种性质良性而行为却类似恶性的疾病长期困扰着临床治疗。传统的药物和手术治疗等方法存在较大副反应及较高复发率[1]。因此,寻求新的治疗措施如“源头治疗”成为近几年研究热点。本文通过建立 Wistar大鼠子宫内膜异位症动物模型,观察川芎嗪对大鼠异位内膜血管生成的抑制作用,为抗血管生成治疗子宫内膜异位症提供新的药物及实验依据。

1 材料方法

1.1 主要试剂

盐酸川芎嗪注射液(TM P,无锡市第七制药厂,40mg/2mL,批号9803161)。鼠抗人 CD34免疫组化单克隆抗体、S-P超敏试剂盒(鼠 /兔)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 动物模型的构建

50只雌 性 Wistar大鼠(60～ 70d)体重 190～ 240g购自佳木斯大学动物实验中心。术前采用人工动情,大鼠用氯胺酮麻醉后,消毒腹部 ,剃除手术区的被毛 ,碘酊消毒手术区;于腹中线尿道上1cm处行纵向切口,长约2cm,挑出右侧子宫角,切取长1cm子宫组织,剪成5mm×5mm的内膜组织片段。将其内膜面向子宫体与直肠之间的后壁进行四角缝合,关闭腹腔。每日腹腔注射4万 u/mL庆大霉素0.1mL,连续使用3d。4周后第 2次开腹观察结果,成模的大鼠经大体观察和组织学证实并测量移植物体积。

1.3 实验分组

将成模的大鼠40只随机分为四组。3个实验组分别给予：TM P50 mg˙kg-1˙d-1、TM P 100mg˙kg-1˙d-1、TM P 200mg˙ kg-1˙d-1连续15d,ip。对照组：给予等量的生理盐水。

1.4 观测指标及测定方法

连续给药 15d后 24h第 3次剖腹检查种植物的生长情况。无菌条件下采集大鼠异位内膜组织,4%多聚甲醛液固定。将上述标本经常规处理,切成 5μm厚的石蜡切片,进行免疫组化的检测。用鼠抗人 CD34免疫组化单克隆抗体进行微血管密度(MV D)检测;采用两步法。

血管计数：免疫组织化学染色后先在低倍下选择内皮细胞染色最多的区域,再在高倍镜下下寻找将胞质呈黄染的与周围其他组织有明显界限的内皮细胞或内皮细胞串,无论有无管腔,计数为1个血管。计数这一区域的血管个数,记录每高倍视野的血管数,选血管数最多的5个数值的平均数作为MVD。

1.5 统计学处理

应用 SPSS13.0统计软件包进行统计分析。实验结果以s表示,各组间差异采用配对 t检验,直线相关分析,以 P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 治疗前后各组移植物体积的比较

将造模成功的40只大鼠随机分为 4个组,两脚规测量种植物的体积。

表1 治疗前后移植物体积(mm3)的比较 (±s,n=10)

表1 治疗前后移植物体积(mm3)的比较 (±s,n=10)

△与治疗前相比 P＜0.01,▲与对照组比较 P＜0.05。

组别 治疗前体积 治疗后体积对照组 123.10±4.77 129.74±6.59低剂量组 125.96±5.78 117.49±4.82△▲中剂量组 126.26±3.36 101.01±3.15△▲高剂量组 125.70±5.17 77.09±6.82△▲

由表1中可以看出低剂量组的体积由治疗前的125.96mm3下降至117.49mm3,平均下降了6.7%(P ＜0.05),中剂量组由 126.26mm3下降至 101.01mm3,平均下降了19.9%(P ＜0.01),高剂量组由125.70mm3降至77.09mm3,平均降了38.6% (P＜0.01),而对照组的体积较治疗前有所上升达到 129mm3。

2.2 各组在位和异位内膜 MVD值比较

见表 2。

表2 各组在位和异位内膜 MVD值比较 (±s,n=10)

表2 各组在位和异位内膜 MVD值比较 (±s,n=10)

★与对照组比较 P＜0.05,▲与低剂量组比较 P＜0.05。

组别 在位内膜 异位内膜对照组 19.73±0.26 23.51±0.54低剂量组 18.23±0.51 11.44±0.57★中剂量组 16.41±0.26 10.05±0.56★▲高剂量组 16.26±0.23 8.34±0.44★▲

由表2可以看出治疗后低剂量组、中剂量组、高剂量组与对照组相比,MVD值表达有显著差异 (P＜0.01),各组随着剂量的增加 MV D值也明显减少。

3 讨论

子宫内膜异位症常用的动物模型有猕猴、狒狒、兔和大鼠等。猕猴、狒狒等非人灵长类动物具有自发的子宫内膜异位症的发生率,与人类最为相似,是最好的模型动物,但是非人灵长类动物由于价格昂贵,饲养要求高,且疾病自发率低,极大的限制了其在研究中的广泛应用[2]。本实验选择 Wistar大鼠,是因其激素水平较高,性周期短且规律,对移植物的成活和移植后的观察均较为有利,且较经济,手术移植法的成功率较高。本实验的建模成功率为80%与多数学者报道的结论一致[3]。目前 EMs的治疗仍然是个十分棘手的问题,治疗手段主要是手术、药物、或者手术合并药物治疗,现行的药物治疗主要是内分泌激素药物治疗,只能抑制症状,不能清除异位病灶[4]。随着对病因学的深入研究和分子生物学等相关科学的快速发展,抗黏附、抗炎症、免疫调节剂和激素受体调节剂等“源头治疗”,己成为研究热点,为治疗提供全新的对策。近年在动物实验中探索一种以抑制异位病灶新生血管为靶点的治疗 EMs的新方法。蒋红清[5]等用抗血管生成剂作用在鸡胚尿囊膜子宫内膜异位病灶和小鼠子宫内膜异位病灶,证实抗血管生成治疗 EMs的策略具有可行性,将成为治疗的有效手段之一。近年来国内外研究表明川芎嗪具有广泛的体内外抗肿瘤效应[6],而其中的一个重要机制就是抑制肿瘤的新生血管形成。文献报道[7]川芎嗪浓度在 160 μg/mL抑制体外培养的内皮细胞生长,我们的研究结果再次证明,川芎嗪能抑制血管内皮细胞的增殖,同时发现川芎嗪亦能抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖。这可能是川芎嗪抑制血管生成的机制之一。本实验免疫组化结果表明,川芎嗪可以抑制 MV D在肿瘤组织中的表达;以上结果均提示川芎嗪有抗肿瘤新生血管形成作用。由于肿瘤组织中新生血管形成的机制与 EMs新生血管形成的机制有相似之处,均是通过局部VEGF等血管形成促进因子的超常表达诱发新生血管的形成,因此本实验采用川芎嗪治疗大鼠子宫内膜异位症,并通过种植物体积及 MVD值的改变,进一步证实川芎嗪对异位病灶的血管生成抑制作用的,有望成为 EMs抗血管生成治疗新药。

[1]赵玉,黄向华.子宫内膜异位症治疗进展 [J].河北医科大学学报,2006,27(5)：503

[2]D’Hooghe TM.Clinical relevance of the baboon as a model for the study of endometriosis[J].Fertil Steril,1997,68(4)：613-625

[3]张薇,沈红沁,黄启玲,等.非动情期 SD大鼠子宫内膜异位症模型的建立 [J].中国实验动物学报,2004,12(1)：21-24

[4]郎景和.子宫内膜异位症的研究与设想 [J].中华妇产科杂志,2003,38(8)：478-480

[5]蒋红清,李亚里,邹杰,等.抗血管生成治疗子宫内膜异位症的实验研究 [J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(5)：369-372

[6]陈刚,徐晓玉,严鹏科,等.川芎嗪和丹参对小鼠 Lewis肺癌生长的抑制与抑制血管生成的关系 [J].中草药,2004,35(3)：296

[7]杨丽蓉,徐晓玉.川芎嗪对 V EGF诱导的血管内皮细胞增殖的影响 [J].中国中医基础医学杂志,2005,11(4)：278-279