3种有机磷农药对黑鲷幼鱼的急性毒性研究

刘祖毅，王志铮，吕敢堂，邵国洱，包坚敏

（1.嵊泗县海洋与渔业局，浙江嵊泗 202450；2.浙江海洋学院水产学院，浙江舟山 316004；3.舟山市三鑫水产养殖有限公司，浙江岱山 316200；4.岱山县海洋与渔业局，浙江岱山 316200）

农药作为一类常见的环境污染物，是水域环境安全评价的重要监测对象，同时，其对水生经济动物的影响是生态毒理研究的重要内容之一。在当前食品安全和生态安全备受关注和重视的大背景下，如何有效规避和遏制因农药使用与管理失控而引发的一系列水域环境污染和生物生理受损等现实问题，以达到合理有效控制水域中农药限量水平的目的，已成为保护与改善水域环境，保障水生生物生态安全的重要命题之一。

黑鲷Acanthopagrus schlegel俗称黑加吉、铜盆鱼等，隶属于鲈形目、鲷科、鲷属。因其具营养经济价值高，生长快，食性杂，温、盐适应性广，抗病力强和易于饲养等特点，自20世纪80年代人工育苗技术获得产业化突破以来，一直是我国沿海重要的海水养殖鱼类之一。近期国内外关于黑鲷生态毒理学方面的研究较活跃，但所涉及的毒物仅为常见重金属离子[1，2]和常用消毒剂[3，4]，有关农药对其存活的影响迄今尚未见报道。鉴于此，笔者于2008年7-8月在舟山市三鑫水产养殖有限公司内开展了乙酰甲胺磷、辛硫磷、三唑磷等3种常见有机磷农药对黑鲷幼鱼的急性致毒效应研究，以期为黑鲷逆境生理生态研究积累相关资料，为海水养殖环境的生态风险评估与管理以及相关渔业污染事故处理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究所用黑鲷幼鱼由舟山市三鑫水产养殖有限公司提供，选取反应灵敏、无伤病、规格相近的健壮个体作为实验对象（具体规格为体长 5.09±0.71 cm、体重 2.09±0.66 g），在室内育苗水泥池驯养 3～4 d 后备用。

1.1.2 试剂

乙酰甲胺磷（有效成分及含量：O，S-二甲基乙酰基硫代磷酰胺酯，30%）购自湖北沙隆达股份有限公司，辛硫磷乳油[有效成分及含量：O，O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，40%]购自山东胜邦鲁南农药有限公司，三唑磷乳油[有效成分及含量：O，O-二乙基-O-(1-苯基-l，2，4-三唑-3-基)硫代磷酸酯，20%]购自福建省建瓯福农化工有限公司。实验时用蒸馏水将各实验药物配成一定质量浓度母液，现配现用。

1.1.3 理化条件

实验用海水为经 48 h 暗沉淀、二级沙滤处理的自然海水，水温 27.2～30.4 ℃，盐度 27～29，pH 8.24，水质符合渔业水质标准(GB 11607-1989)。

1.2 试验方法

经预备实验，确定各实验药物质量浓度范围（96 h全活质量浓度上限和96 h全致死质量浓度下限）后，在室温条件下，以自然状态为对照，以规格60 cm×80 cm×60 cm的白色PVC水箱为实验容器（实验实际容积为20 L），按等差间距法设置若干质量浓度梯度组，采用静水停食实验法，开展单一药物对黑鲷幼鱼的急性毒性实验。每一质量浓度梯度各放实验动物10尾，组内设3个重复，连续观察受试对象的活动状况，以多次用镊子碰触鱼体表面完全无反应作为死亡判断标准，及时取出死亡个体，每24 h换液并统计1次总体平均死亡率。为减少实验容器对农药的吸附，实验前用对应的药物质量浓度浸泡24 h以上。

1.3 数据处理

根据实验药物对黑鲷幼鱼的急性毒性实验结果，借助SPSS17.0分别建立24 h、48 h、72 h和96 h 4个不同观察时段的死亡概率单位—质量浓度直线回归方程，采用r相关系数（P＜0.05为显著水平）和F值（P＜0.05为显著水平）检验该方程的可靠性，并应用药物毒性蓄积程度系数MAC分析生物体对实验药物的蓄积与降减动态[5]。各实验药物的安全质量浓度计算公式如下：

式中，SC为安全质量浓度值，96 h LC50为黑鲷幼鱼染毒96 h后的半致死质量浓度值[6]。

2 结果与分析

2.1 中毒症状

观察发现，黑鲷幼鱼不仅在农药不同实验质量浓度下表现出不同的中毒反应，而且其对不同种农药的耐受力也存在明显差异。实验初期，低质量浓度组的幼鱼活动状况与对照组基本相似，集群于实验容器中部水层缓慢游动，48 h内各实验药物低质量浓度组幼鱼绝大多数个体活动状况几无变化，死亡个体极少；高浓度组幼鱼放入实验容器后即显不安，在实验容器中快速游动，24 h内部分个体呼吸变得急促并伴有浮头现象，对外界刺激反应也变得较为迟钝，活力明显弱于低质量浓度组，其中乙酰甲胺磷高浓度组幼鱼死亡率明显高于辛硫磷和三唑磷达40%以上。随着实验时间的进一步延长，各实验梯度组死亡个体不断增多。黑鲷幼鱼的中毒死亡过程表现为：呼吸短促，鳃丝充血，鱼体上浮，继而胸鳍和腹鳍根部变红，尾鳍、腹鳍弯曲，鱼体失衡“倒挂”，最后静卧于实验容器底部直至死亡。

2.2 农药对黑鲷幼鱼的急性毒性效应

由表1可见，随着实验质量浓度的提高和实验时间的延长，3种有机磷农药对黑鲷幼鱼的急性毒性效应均明显增强，死亡率也明显升高，但不同实验药物对黑鲷幼鱼的急性毒性影响却不尽相同，主要表现为：（1）致死陡度不同。各实验药物质量浓度梯度组间对黑鲷幼鱼的致死陡度随观察时段的推移而变化，按时序依次表现为：乙酰甲胺磷＞三唑磷＞辛硫磷（0～24 h）、乙酰甲胺磷＞三唑磷≈辛硫磷（24～48 h）、辛硫磷＞三唑磷≈乙酰甲胺磷（48～72 h）及辛硫磷≈三唑磷＞乙酰甲胺磷（72～96 h）；（2）死亡率增速不同。在实验质量浓度范围内，随染毒时间的延长，各实验药物高质量浓度梯度组（96 h死亡率＞50%）间，死亡率增速依次呈现为：辛硫磷＜乙酰甲胺磷＜三唑磷（0～24 h）、三唑磷＜辛硫磷＜乙酰甲胺磷（24～48 h）、乙酰甲胺磷＜三唑磷＜辛硫磷（48～96 h），而低质量浓度梯度组（96 h死亡率≤50%）间则几无差异；（3）毒性强度不同。从实验质量浓度范围以及不同观察时段对黑鲷幼鱼的急性毒性结果来看，三唑磷毒性强度为最大，辛硫磷次之，乙酰甲胺磷最低，其中三唑磷毒性强度分别约为辛硫磷的10倍和乙酰甲胺磷的300倍。

表1 不同观察时段3种有机磷农药对黑鲷幼鱼的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of three common pesticides on Trionyx sinensis juveniles at intervals of time at different dose

3 讨论

3.1 乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷对对黑鲷幼鱼的急性致毒效应特征

鱼类乙酰胆碱酯酶(AchE)主要存在于神经组织和血细胞中，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷均属以触杀和胃毒作用为主的有机磷农药，它们引起鱼类中毒的机制主要是通过对AchE活性中心的丝氨酸进行羟基磷酸化，抑制AchE活性，造成体内乙酰胆碱大量蓄积，运动神经传递受阻来实现的。同时研究也表明，干扰诸如线粒体呼吸、碳水化合物代谢、蛋白质合成等一系列生化过程也是有机磷农药对鱼类诱毒的分子机制之一[7]。

从实验中毒症状来看，黑鲷幼鱼对有机磷农药中毒致死过程依次由呼吸短促，鳃丝充血，继而胸鳍和腹鳍根部变红，尾鳍、腹鳍弯曲，鱼体失衡“倒挂”，最后静卧于实验容器底部直至死亡来完成的。本研究认为其中毒过程是由农药在体内不断蓄积致使运动神经传递受阻和生化过程受扰共同引发所致。

农药分子结构与致毒机制的差异，以及实验生物间生理与代谢特征的差别，必然导致实验生物对各种农药表现不同的耐毒能力。从本研究来看，在染毒96 h后死亡率相近的组别中（以死亡率50%为例，见表1），黑鲷幼鱼致死率增加值随观察时段依次呈现为三唑磷＞乙酰甲胺磷=辛硫磷（0～24 h）、三唑磷＞辛硫磷＞乙酰甲胺磷（24～48 h）、乙酰甲胺磷＞三唑磷=辛硫磷（48～72 h）和辛硫磷＞三唑磷=乙酰甲胺磷（72～96 h），表明在相同急性毒性水平下，三唑磷、辛硫磷和乙酰甲胺磷在黑鲷幼鱼体内的侵入和蓄积速率的高低在时序上存在明显的阶段性差异，即三唑磷、乙酰甲胺磷和辛硫磷分别在实验早、中、后期具较强的毒发效应。乙酰甲胺磷作为甲胺磷的N-乙酰基衍生物，本研究中其毒性明显弱于三唑磷的情形已在对厚壳贻贝Mytilus coruscus幼贝[8]、麦瑞加拉鲮鱼Cirrhinus mrigala幼鱼[9]、婆罗异剑水蚤Apocyclops borneoensis和日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus[10]的研究中得到证实，其毒性强度低于三唑磷和辛硫磷的结果也与SULTAATOS等得出的二甲基硫代磷酸酯（乙酰甲胺磷）可被生物体内谷胱甘肽—S—转化酶（GSTs）转甲基而脱毒，而乙基硫代磷酸酯（三唑磷、辛硫磷）分子较大阻碍了这种转化使毒性明显增强的结论[11]相吻，至于本研究中辛硫磷毒性明显弱于三唑磷的结果是否为(1-苯基-l，2，4-三唑-3-基)基团较(苯乙腈酮肟)基团与AchE具更强的亲和力所致尚待进一步验证。同样，关于乙酰甲胺磷对鲫鱼、鲤鱼和鲢鱼的毒性强度与辛硫磷相近[12]的报道与本研究结果相悖的原因也有待进一步深入研究。

3.2 乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷对黑鲷幼鱼的急性致毒效应和蓄积与降减特征

对表1数据作统计学处理得表2。由表2可见，3种农药在相同实验时间条件下，不同实验质量浓度梯度组的致死效果存在显著差异，通过建立死亡概率单位—质量浓度回归方程，均显示出较好的拟合度（r＞r0.05；另除辛硫磷 0～24 h、乙酰甲胺磷 24～48 h 时段外，F 均大于 F0.05），表明黑鲷幼鱼受农药胁迫下的致死率与其实验质量浓度密切相关。

表2 不同观察时段3种常见农药对黑鲷幼鱼急性毒性特征的分析Tab.2 Analysis of feature of the acute toxicity of three common pesticides on Trionyx sinensis juveniles at intervals of time at different dose

毒物在生物体内的蓄积与降减情形是评价毒物毒效和分析生物耐毒能力的基础。由表2可见，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷MAC值均为正值，表明它们在黑鲷幼鱼体内蓄积作用较降解作用而言，一直处于优势地位。但因农药分子结构与致毒机制的差异，致使其MAC值的变化不尽一致。乙酰甲胺磷和三唑磷MAC值随实验时间延长而梯次减少，表明乙酰甲胺磷和三唑磷在实验早、中期就表露出极强的蓄积作用，并表露死亡高峰，同时也为后续死亡率的明显上升奠定了基础；辛硫磷MAC值在48～72 h时段最大高达75.00，24～48 h时段最小仅为5.00，表明实验早期黑鲷幼鱼对辛硫磷有较强的降减能力，至48 h后这种降减能力迅速减弱，毒物蓄积作用明显占据优势，并于48～72 h时段表露死亡高峰，72 h后蓄积作用逐渐减弱，致死压力继续增强。以上分析与表1和表2结果一致。

3.3 关于黑鲷幼鱼对乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷安全浓度的评价

由表2可见，乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷对黑鲷幼鱼半致死质量浓度96 h LC50值依次为14.07 mg/L、0.30 mg/L和0.051 mg/L，按农药对鱼类的毒性等级标准评价[13]，乙酰甲胺磷对黑鲷幼鱼属低毒，三唑磷和辛硫磷均属高毒。将乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷对黑鲷幼鱼的安全质量浓度（依次为1.41 mg/L、0.03 mg/L和0.005 mg/L）与我国渔业水质标准（GB11607-1989）规定的甲胺磷（O，S-二甲基硫代磷酰胺）、马拉硫磷[二硫代磷酸O，O-二甲基-S-（1，2-二乙酯基乙基）酯]和甲基对硫磷（硫代磷酸-O，O-二甲基-O-对硝基苯基酯）高限（依次为1 mg/L、0.005 mg/L和0.000 5 mg/L）相较[10]，表明黑鲷幼鱼对乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷都具较强的敏感性，故应加强养殖水体中乙酰甲胺磷、辛硫磷和三唑磷含量的监控工作，确保其生存安全。

致谢：蒙舟山市三鑫水产养殖有限公司提供实验场地和部分试验用具，本校2005级水产养殖专业陈勇强、陈吕力、李俊华、胡虹菲等同学参与本研究部分实验工作，谨表谢忱！

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