补阳还五汤对血管性痴呆大鼠行为学和海马神经元形态学的影响1)

李 君,钱 涛,高维娟,唐敬龙,张鸿波

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由脑血管疾病所致的智能及认知功能障碍临床综合征,它是老年期痴呆中的一种常见类型。在西方国家,VD成为继阿尔茨海默病(A lzheimer's,AD)之后第二位导致痴呆的病因,而亚洲VD的发病率较高,主要与中风高发有关[1]。随着人口的老龄化、饮食结构的改变,VD的发病呈增加趋势。因此,积极探讨VD的发病机制和治疗方法,具有重要意义。目前,临床上治疗VD有多种药物,如胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂、钙通道阻滞剂和神经营养药物等,但其疗效没有确切统一的结论,分析与VD发病机制的多样性、复杂性有关。中药成分复杂,有望在治疗VD方面起到改善认知功能的作用。VD属中医“呆病”范畴,辨证多属气虚血瘀症,治以益气活血为主。补阳还五汤作为益气活血中药的代表方剂,具有补气、活血、通络之功效。本实验旨在观察补阳还五汤对VD模型大鼠行为学及海马组织形态学的影响,为临床治疗VD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康SD雄性大鼠60只,体重20 0 g～250 g,由北京维通利华动物实验中心供给,合格证号为SCXK(京)2007-0001。实验条件下自然饮食,适应环境一周后进行实验。

1.1.2 仪器 Morris水迷宫(LW2II型,中国医学科学院药物所);连续变倍体视显微镜(XTS20型,北京);冰冻切片机(LEICA CM 1800,Germany);图像分析仪(Beckman公司,USA);胶冻剂(Thermo Shandon,USA);WH-A300W高频电刀(北京);江湾Ⅰ型C立体定向仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1.1.3 药物和试剂 补阳还五汤由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成(北京同仁堂医药公司承德分公司提供,批号:080103);尼莫地平片(天津华津制药厂,国药准字H 41022175,批号:080317,规格20 mg);Sodium Pentobarbitone(10 g,Germany);多聚甲醛(分析纯,天津市化学试剂研究所,批号970606);磷酸氢二钠(分析纯,天津市化学试剂六厂,批号970413),磷酸二氢钠(分析纯,天津市化学试剂六厂,批号970726)。

1.2 方法

1.2.1 药物处理 补阳还五汤方剂组成及比例,黄芪∶当归∶赤芍∶地龙∶川芎∶红花∶桃仁(80∶4∶3∶2∶2∶2∶2),1 g药物相当于1 g生药,按本室方法制备浓度为12.5 g/m L的水煎醇提液,实验时用双蒸水配成浓度为6.25 g/m L的混悬液。尼莫地平用双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为2.5 mg/m L的混悬液。高压灭菌,置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 模型制作 采用Pullinsin-4VO改良法制成VD大鼠模型。大鼠腹腔注射1%Sodium Pentobarbitone(10 mg/m L)45 mg/kg麻醉。假手术组大鼠不热凝椎动脉和不夹闭颈总动脉,其他手术进程同模型组;正常组大鼠不作任何手术处理。

1.2.3 动物分组及给药方法 将造模成功的大鼠随机分成模型组、补阳还五汤组和尼莫地平组。另设假手术组及正常对照组,每组12只。补阳还五汤用量为50 g/(kg◦d),尼莫地平用量为20 mg/(kg◦d),模型组、假手术组和正常对照组均给予蒸馏水1m l/100 g灌胃。术后第1天即用药,每日灌胃1次,共给药30 d。

1.2.4 Morris水迷宫试验

1.2.4.1 定位航行试验 试验历时4 d。每只大鼠每天从4个不同象限入水点入水进行训练,各1次,取平均值为每天逃避潜伏期。训练中,若大鼠在60 s内找到平台,于平台上站立10 s;若未找到,用棒将其引上平台,站立10 s,潜伏期限记为60 s。将大鼠从平台上拿下来休息60 s之后,再按序由下一入水点入水进行下一次实验。

1.2.4.2 空间探索试验 第5天撤去平台,将大鼠从第二象限入水点放入水槽,记录60 s内其经过平台象限的次数,即为空间探索次数。

1.2.5 海马组织形态学观察 术后30 d,常规取材、固定,用1%Sodium Pentobarbitone 45mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰卧固定,剪开右心耳。开颅取脑,并将脑组织置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h(4℃)后,取视交叉后4 mm与小脑前之间的部分即海马脑组织,组织经蔗糖溶液脱水。HE染色,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,光镜下观察海马形态学变化。

1.2.6 海马CA 1区神经元数目和丢失率的检测 以图像分析仪分别对HE染色图片的海马CA1区进行处理,测量单位面积海马神经元数目。采用甲苯胺蓝染色计数海马CA 1区残余神经元,结果以神经元丢失率(LR)表示。

2 结 果

2.1 行为学检测 M orris水迷宫定位航行实验中,模型组的逃避潜伏期明显长于正常对照组(P＜0.05),补阳还五汤组和尼莫地平组明显短于模型组(P＜0.05)。在空间探索实验中,模型组的空间探索次数明显少于正常对照组(P＜0.05),而补阳还五汤组和尼莫地平组明显多于模型组(P＜0.05)。和正常对照组相比,假手术组大鼠逃避潜伏期、空间探索次数均无(P＞0.05)。详见表1。

表1 Morris水迷宫实验结果(±s)

表1 Morris水迷宫实验结果(±s)

组别n逃避潜伏期s探索次数/m in正常对照组12 7.67±3.42 16.86±5.37假手术组12 8.76±4.03 14.42±4.01模型组12 29.56±13.281)4.26±0.801)补阳还五汤组12 16.96±7.062)8.96±1.302)尼莫地平组12 20.16±8.892)8.74±2.522)与正常组相比,1)P＜0.05;与模型组相比,2)P＜0.05

2.2 脑组织海马CA1区神经元形态学 H E染色后正常对照组和假手术组大鼠海马CA 1区神经元形态规则,层次丰富,细胞线清晰,细胞排列整齐密集,胞核、胞质清晰;模型组大鼠海马CA 1区神经元排列紊乱、松散,细胞周围出现间隙,核固缩,染色质深染,可见凝固性坏死伴明显细胞脱失;补阳还五汤组和尼莫地平组海马CA 1区神经元形态介于正常组、假手术组和模型组之间,可明显减轻海马内核固缩现象。

2.3 脑组织海马CA1区神经元数目和丢失率 和正常对照组相比,假手术组神经元数目和丢失率无明显变化;模型组大鼠海马CA 1区神经元脱失明显,数目减少,神经元丢失率升高(P＜0.05),可见胶质细胞增生;较模型组相比,补阳还五汤组和尼莫地平组均可见海马CA 1区神经元脱失现象明显减轻,数目增多,神经元丢失率明显降低(P＜0.05)。详见表2。

表2 大鼠海马CA 1区单位面积神经元数(±s)

表2 大鼠海马CA 1区单位面积神经元数(±s)

组别n神经元数/mm2神经元丢失率%正常对照组12 97.28±10.12 0假手术组12 82.56±6.36 1.62±1.70模型组12 44.62±7.351)50.98±5.211)尼莫地平组12 65.32±5.802)16.86±4.172)补阳还五汤组12 74.72±6.502)15.59±3.752)与正常对照组比较,1)P＜0.05;与模型组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

血管性痴呆是老年期痴呆的一种重要类型,脑缺血造成海马损伤引起学习记忆能力下降,是发生VD的重要原因。而海马是缺血损伤最敏感脑区,直接参与信息贮存和回忆[2,3]。赵建新等[4]认为海马CA1区神经元的迟发性死亡可能是缺血性脑血管病导致痴呆的主要原因。即使短暂的脑缺血也可造成神经元延迟性神经元死亡[5]。本实验模型组大鼠海马CA1区神经元明显减少,丧失率明显升高;补阳还五汤组神经元形态和数量则非常接近假手术组和正常组,表明补阳还五汤可以保护缺血对CA 1区神经元的损伤。

益气活血中药有显著的抗VD作用,可明显改善VD模型大鼠的学习、记忆能力[6-10]。补阳还五汤作为益气活血中药的代表方剂具有补气、活血、通络之功效。君药黄芪可补诸虚不足,益元气;臣以当归,原方用归尾,归尾主通,逐瘀自验;赤芍、川芎、红花、桃仁四味为佐,协同归尾以活血化瘀;地龙通经活络,力专善走,配合诸药以行药势,用以为使。全方重用补气药配合小量活血化瘀药,使周身元气流通,血无凝滞。补阳还五汤具有抑制血小板聚集、改善血液流变学状态、调节脑组织能量代谢和一氧化氮(NO)的生成、抑制脑组织细胞凋亡等作用,从而保护神经元[11-12]。尼莫地平是二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂,具有改善脑循环和脑代谢的作用,临床上可用于治疗轻重度±s)VD[13]。本实验证明,补阳还五汤和尼莫地平都可改善VD大鼠学习记忆能力,且补阳还五汤组优于尼莫地平组,补阳还五汤能明显减轻缺血对海马的损伤,保护神经元,提高VD大鼠Morris水迷宫成绩,这可能是其增强学习记忆的机制之一。但对其改善学习记忆能力的机制值得进一步探讨。

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