用阻抗法快速测定巴氏奶中菌落总数

2010-06-27谷福

大众标准化 2010年1期

谷福

0 前言

目前我国进行食品质量安全准入制度（QS），菌落总数作为巴氏奶的出厂检验项目是判定食品被微生物污染程度的重要指标之一，按国标GB/T 4789.2进行检测，菌落总数的结果的报出需要48h，但是巴氏奶的保质期只有3d。为了延长巴士奶的货架期，减少检验的时间，有必要为寻求一种快速、有效、简便的检测方法,本文用BacTrac4300“微生物定量分析仪”,对巴氏奶中菌落总数进行测定。实验说明，用阻抗法代替GB/T 4789.2测定巴氏奶的菌落总数作为出厂检验项目是可行的，需要实验时间约4h～6h，具有快速准确的特点。

1 阻抗法实验原理

阻抗法是通过测量微生物代谢引起的培养基电特性变化来测定样品微生物含量的一种快速检测方法。微生物在培养过程中,生理代谢作用使培养基中的物质（如碳水化合物、类脂、蛋白质）等大分子物质转化为醋酸盐、乳酸盐或氨盐等小分子物质电活性物质。研究表明，随着微生物增长,培养基中电活性分子和离子增多，使导电性增强,电阻抗降低。电导率随时间的变化曲线与微生物生长曲线相似,出现缓慢增长期、加速增长期、指数增长期和缓慢减少期,最后趋于稳定期。微生物的起始数量不同,出现指数增长期的时间也不同,通过建立二者之间的关系,就能通过检测培养基电特性变化推算出微生物的起始菌量。将培养基阻抗变化的相对值定义为 M值，M=（R0-RT）/R0×100%,其中，R0 表示测量开始时培养基的阻抗值，RT表示测量开始后任意时刻培养基的阻抗值，M值最终表示了培养基电阻减少的百分数。电阻越小微生物越多。因此测定M值的变化，即可检出微生物的数量。为描述因微生物的显著生长而引起培养基阻抗的下降，需要设定一个M值的阈值，从测量开始到该微生物生长曲线达到设定的阈值所需的时间就是阻抗检测时间（IDT）。微生物的起始数量不同,出现指数增长期的时间也不同,在一定范围内，菌落形成单位（CFU）的对数Log（CFU）与IDT呈直线关系，通过测定同类样品的一系列CFU（平板计算法）和相对应的IDT，即可制定出标准曲线。通过建立二者之间的关系,就能通过检测培养基电性变化推出微生物的原始菌量。对于未知样品，只要检测其IDT，查标准曲线，就可以得到CFU值。

本研究用我实验室已制成巴士奶标准曲线分别用仪器法和国标法测样品的菌落总数并将结果进行了比较。

2 材料和方法

2.1 仪器和试剂

（1）BacTrac4300微生物定量分析仪,检测菌落总数培养基BiMedia002A由SY-LAB提供。

（2）平板计数琼脂培养基（GB/T 4789.2-2008），广东省环凯微生物科技有限公司。

2.2 检测样品

市售的巴士奶10个批次。

2.3 平板计数法

按国标GB/T 4789.2-2008操作，加入1∶10样品稀释液，36±1℃培养 48h。

2.4 阻抗测定法

每个测定瓶加入9mlBiMedia002A培养基，高压灭菌，测定前将测定瓶置于36℃，10个巴氏奶样品，共用20个测定瓶，取1mL样品，样品按GB/T 4789.2-2008进行做10-1、10-2、10-3等稀释,各取1ml样品稀释液加入1个测定瓶,然后放入BacTrac4300。记录结果由计算机输出。仪器设置：温度:30℃，最大反应时限：24h，测量间隔:5min，M-value 的阈值:5%，输入样品标记，有计算机自动控制测量模式。

2.5 标准曲线的建立

对同一样品，用平板法和阻抗法同时进行样品测定。当Bactrac的细菌生长曲线达到设定的阈值时，测定结束，仪器将自动记录的数据为阻抗检测时间（IDT）。将平板计数所得数据和对应的IDT值输入计算机，Bactrac即以IDT为横坐标，以log（CFU）为纵坐标，用直线回归法作二者相关的标准曲线。

2.6 样品的检测

对于每个厂家的产品都做一个标准曲线，把样品1∶10稀释后接种检测瓶，选定标准曲线即开始检测。测试结束后，Bactrac根据该样品的IDT值从标准曲线上自动计算出CFU。

3 结果判断

（1）按国标GB5408.1,巴氏奶菌落总数≤30000CFU/ml为合格。

（2）仪器法：根据本实验室做的二条标准曲线,消毒牛乳为DT≥3.0h为合格。

4 结果讨论

实验结果（表1，表2）表明，巴氏奶的两种检测方法在合格率和数值无显著性差异（p＞0.05），这两种方法的优缺点比较：①仪器法利用电阻抗可测试菌落总数，具有时间短的特点，国标法耗时，需2d，而电阻法可在短时间内（4h～6h）检测大量样品，如样品菌含量越多，出结果越更快。②仪器法简单、方便，巴氏奶样品可直接进行检测或某些巴士奶的样品如果含有高的盐分。这些盐离子使培养基本身带有很强的导电性，掩盖了微生物代谢产生的阻抗变化，需要进行稀释后再测。③仪器法由计算机控制检测过程，实验数据自动记录，自动分析、储存，图表、数据一目了然，操作者的误差机会较少。④仪器法的缺点是必须先做标准曲线才能使用，测定用的试剂价格较贵。⑤通过电子测量技术，一旦微生物数量增殖达到106CFU/ml～107CFU/ml时，即可检测信号的变化，这与平板法的108CFU/ml～109CFU才能形成一个可视菌落相比，检测灵敏度比平板法高出近1000倍。