杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产的相关性①

徐金娥 杨晓菊 张 云 江秀丽 陈子江 (青岛大学医学院附属医院生殖医学科,青岛 266003)

不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上的自然流产,排除解剖结构、染色体、内分泌、自身免疫功能异常以及生殖道感染等因素,发生率0.5%～1%。近年来将连续发生2次或2次以上的流产也称为复发性流产,其发生率为5%[1]。生殖免疫学研究发现,约50%～60%的早期URSA的发生与免疫因素有关[2],尤其是与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer immunoglobulin-like re-ceptors,KIR)及人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)的关系已成为生殖免疫研究的热点[3]。蜕膜自然杀伤细胞(Natural killer,NK)与绒毛滋养细胞之间存在复杂的识别机制,母体KIR与胎儿HLA-C基因组成特异性信号传导通路影响NK细胞的功能,在胚胎种植及妊娠维持过程中发挥重要作用[4]。为探讨KIR、HLA-C基因与URSA易感性的关系,我们对蜕膜KIR基因、绒毛滋养细胞HLA-C基因多态性进行分析,探讨免疫遗传因素在URSA中的作用,为URSA的病因诊断和临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病例组(URSA组)选择2006年1月至2008年2月在山东省立医院生殖中心就诊的不明原因早期复发性流产患者38例,年龄32.34±7.22岁,孕周9.64±2.89周。诊断标准参照文献[5]。所有患者平素月经规律,内分泌化验正常,无TORCH病毒感染史,抗心磷脂抗体(ACA)、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体(dsDNA)、抗精子抗体(AsAb)检测阴性,经阴道超声、子宫输卵管碘油造影及宫腔镜检查生殖系统解剖正常,ABO血型抗体检测抗A-IgG、抗B-IgG滴度低于1∶64,夫妇双方及胚胎染色体核型分析正常。符合上述条件者纳入URSA组。

对照组选择同期在计划生育门诊行人工流产术的正常早孕妇女35例,年龄30.23±6.16岁,孕周8.61±2.11周,超声证实胚胎发育正常,平素月经规律,无自然流产、死胎、死产史。URSA组与对照组的年龄、孕周均无统计学差异。本研究经山东省立医院伦理委员会批准,所有对象均签署知情同意书。

1.2 标本保存 人工流产术时留取URSA患者和正常早孕妇女的蜕膜及绒毛组织,PBS缓冲液漂洗分装,迅速投入-196℃液氮冻存备用。

1.3 序列特异性引物聚合酶链反应法检测蜕膜组织KIR基因 抽提蜕膜组织基因组DNA,用乙醇沉淀,析出后溶入ddH2O中。序列特异性引物聚合酶链反应(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP)检测蜕膜组织KIR基因,反应体系20 μ l,含 dNTP 终浓度 2 mmol/L,MgCl22 mmol/L,引物终浓度214.3 nmol/L。反应条件:96℃1分钟,96℃25秒,65℃45秒,72℃30秒,5个循环;96℃25秒,60℃45秒,72℃30秒,21个循环;96℃25秒,55℃1分钟,72℃2分钟,5个循环;72℃10分钟。以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4为内参照,不含DNA的PCR体系作阴性对照,所有样本重复测定2次。3个框架基因阳性而引物PCR扩增产物均阴性视为该基因阴性。引物参照文献[6]由上海博亚生物技术有限公司合成,各KIR基因引物序列见表1,PCR产物电泳见图1。

表1 各KIR基因引物序列及片段长度Tab.1 The primer sequencies of KIR genes

1.4 DNA测序法分析绒毛滋养细胞HLA-C基因

抽提绒毛组织基因组DNA,用乙醇沉淀,析出后溶入ddH2O中,吸光度A260/A280比例在1.5～1.9,符合PCR反应要求。PCR反应体系 50 μ l,反应条件:95℃5分钟,95℃30秒,65℃30秒,72℃30秒,5个循环;95℃30秒,60℃30秒,72℃30秒,30个循环;72℃10分钟。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,见图2。剩余PCR产物纯化后,采用美国ABI公司BigDye Terminator v3.1测序试剂盒,按照使用说明在ABI 3100-Avant测序仪上测序,见图3。HLAC DNA引物序列参照文献由上海博亚生物技术有限公司合成,引物序列:Generic forward primer(DNA):5′-TATTGGGACCGGGAGACACA-3′;HLA-C group 1 reverse primer(DNA):5′-GCGGGCAGGGCGGCCGCAGGTTCCGCAAGC-3′;HLA-C group 2 reverse primer(DNA):5′-GCGGGCTGCGCAGTTTCCGCAGGT-3′。

1.5 统计学方法 KIR、HLA-C基因检出频率=检出个数/总数,SPSS软件15.0 Fisher精确概率法计算URSA组与对照组间统计学差异。

2 结果

2.1 蜕膜组织KIR基因频率 用PCR-SSP法进行KIR基因分型,检测了迄今发现的14种KIR基因,结果发现14种KIR基因在URSA组与对照组蜕膜组织中均以不同频率表达,其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因频率为100%;与对照组相比,URSA组蜕膜组织中KIR2DS1的基因频率显著升高(P=0.03),其它KIR基因位点未发现有统计学差异(表2)。

2.2 绒毛滋养细胞HLA-C1、C2基因频率 两组基因HLA-C1、HLA-C2在绒毛组织中呈不平衡表达,以HLA-C1基因占明显优势。URSA组HLA-C1的基因频率为66.67%,对照组HLA-C1的基因频率为81.03%,两组相比差异无显著性,P=0.657;URSA组HLA-C2的基因频率为33.33%,对照组HLA-C2的基因频率为19.07%,两组相比差异有显著性,P=0.007。结果见表3。

图1 一例URSA患者KIR基因扩增产物电泳图Fig.1 KIR genes of one URSA patient

图2 PCR电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR product

图3 HLA-C基因序列Fig.3 HLA-C gene sequence

表2 蜕膜组织KIR基因频率Tab.2 The frequencies of KIR genes in patients compared with control subjects

表3 URSA组与对照组HLA-C基因频率Tab.3 The frequencies of HLA-C genes in patients compared with control subjects

3 讨论

近代生殖免疫学研究发现,50%～60%早期复发性流产的发生可能与免疫因素有关[2]。胚胎带有父方异体抗原成分,母体免疫系统对此进行识别并产生免疫应答,妊娠的成功有赖于母体对胚胎半同种抗原的“免疫耐受”。而正常妊娠的免疫耐受受到诸多因素的影响和制约,任何一个环节出现障碍,都有可能导致妊娠失败,发生流产。由于KIR、HLA均是多肽基因的产物,来自父方的胎儿HLA-C和母体子宫蜕膜NK细胞的KIR之间相互作用,共同参与人类的免疫反应[7,8]。

3.1 蜕膜KIR基因多态性与URSA的相关性 NK细胞是母胎界面的一种重要免疫职能细胞,不仅具有直接的细胞毒素杀伤作用,而且在控制感染和肿瘤细胞因子方面起着至关重要的作用,除此之外,NK细胞的功能与激活性和抑制性信号之间的平衡密切相关[9]。NK细胞表面存在多种受体,其中研究最多的是KIR,KIR调节能力失衡可影响NK细胞的功能,在机体抗感染免疫、肿瘤免疫、移植免疫中发挥作用[7]。人KIR基因是一种跨膜糖蛋白,位于19号染色体的白细胞受体复合体内,具有多基因性和多态性。迄今发现有14个KIR基因和2个假基因,根据其胞外决定簇的数量分为 KIR1D、KIR2D、KIR3D;根据胞浆区长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序的有无,功能上分为抑制性和活化性两种。抑制性或活化性KIR通过与滋养细胞的HLA-I类分子结合来调节NK细胞的功能,在母胎界面发挥重要作用。

Varla-Leftherioti等[10]用 PCR-SSP方法检测了URSA妇女外周血的KIR基因,结果表明,URSA妇女外周血中3种抑制性KIR基因表达下调,而2种激活性KIR基因表达无差异;URSA妇女抑制性KIR缺乏,不能抑制NK细胞的杀伤活性,导致流产[11]。Witt等[12]用相同方法检测了URSA妇女外周血KIR基因的表达,却得出了不同的结论:与正常早孕妇女比较,URSA妇女的KIR基因表型无明显差别。蜕膜NK细胞比全血NK细胞能更多的表达与HLA-C抗原特异性结合的KIR[13,14],为进一步明确KIR与URSA的相关性,我们用PCR-SSP方法检测了URSA与正常早孕妇女蜕膜组织的KIR基因,结果发现14个KIR基因在蜕膜组织中均以不同频率表达,URSA妇女KIR2DS1的基因频率较正常早孕妇女明显升高,KIR谱的平衡向活化性受体倾斜,这与本中心的研究结果一致[15,16]。提示URSA患者蜕膜活化性KIR基因频率增加,母胎界面局部免疫抑制环境失调,蜕膜面局部抑制信号减弱,活化信号增强,可能破坏了母胎界面的免疫稳定状态,使NK细胞功能异常而发生不利于妊娠的免疫反应,发生流产,从基因水平解释了KIR与URSA的相关性。

3.2 HLA-C基因多态性与URSA的相关性 HLA-C属于经典的HLA-Ⅰ类分子,广泛分布于有核细胞表面,根据第77和80位氨基酸的不同,HLA-C分为两组:第一组(HLA-C1),Ser77/Asn80,包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08、Cw12,其 α重链上第 80 位的天冬氨酸是KIR2DL2/2DL3、KIR2DS2/2DS3的特异性识别位点;第二组(HLA-C2),Asn77/Lys80,包括HLACw02、Cw04、Cw05、Cw06、Cw15,其 α重链上第 80 位的赖氨酸是KIR2DL1/2DS1的特异性识别位点。两组HLA-C分别与不同的KIR结合传递活化性或抑制性信号,调控NK细胞的功能,导致某些疾病的发生[17,18]。研究证实所有合体滋养层细胞都表达HLA-C抗原[19],HLA-C配体与KIR相互作用来调控滋养层细胞的侵入和胎盘的形成,而URSA患者绒毛滋养细胞HLA-C基因的研究却报道甚少,绒毛滋养细胞HLA-C基因是否与不明原因早期复发性流产有关,目前尚未明确。Varla-Leftherioti等[10,11]研究显示胚胎HLA-C基因与KIR不匹配可能与自然流产的发生有关。王珊等[15,16]对URSA夫妇进行综合研究发现,URSA患者KIR2DS1基因频率较对照组升高,活化性KIR基因数目明显高于对照组,夫妇双方HLA-C2等位基因减少,可能是不明原因早期复发性流产的发病原因。Hiby等[20]检测了URSA夫妇双方的HLA-C基因,结果显示URSA患者夫妇双方HLA-C2的基因频率明显高于对照组,从而间接推测胎儿的HLA-C2基因频率亦应高于对照组。由于滋养细胞表达父母双方的HLA-C,而对于每次妊娠,胚胎可能表达不同的HLA-C分子,因此直接研究滋养细胞的HLA-C分子可更直观的分析其与URSA的相关性。由于HLA-C分子在细胞表面的表达水平很低,仅为HLA-A、HLA-B抗原量的20%,传统血清学方法在检测HLA-C方面有很大的局限性,故我们采用DNA分型和测序方法分析HLA-C基因多态性。我们对URSA病人与正常早孕妇女绒毛滋养细胞的HLA-C基因进行分析,结果发现HLA-C1、HLA-C2基因在绒毛组织中呈不平衡表达,以HLAC1基因占明显优势。URSA组HLA-C1基因的频率(66.67%)较对照组(81.03%)下降,但差异无显著性;而URSA组HLA-C2基因的频率(33.33%)明显高于对照组(19.07%),两组相比差异有显著性。HLA-C2基因频率升高,HLA-C1、HLA-C2基因失衡可能影响妊娠结局。Yawata等[21]研究表明,HLA-Ⅰ类配体可增加NK细胞表达KIR的频率;Sharkey等[22]则发现蜕膜NK细胞表达的能识别HLA-C抗原的KIR位点大于血中的NK细胞,KIR可增加NK细胞识别母胎界面表达HLA-C抗原的滋养细胞的能力。由此可见,绒毛滋养细胞表达的HLA-C基因可能与蜕膜NK细胞表达的KIR相互影响,相互协调,共同参与妊娠的调节。由于基因组仅是遗传信息的储存体,需通过转录、翻译成蛋白质,才能执行功能,进一步分析蜕膜组织KIR、绒毛滋养细胞HLA-C基因的表达将有助于更好的了解KIR/HLA-C信号传导通路在妊娠中的作用。随着对KIR单元型以及KIR/HLA-Cw复合物等位基因特异性的结构基础认识的逐渐增加,可更好的理解妊娠中KIR/HLA-C同种异体识别的模型。

综上所述,蜕膜NK细胞活化性KIR基因频率增加,与绒毛滋养细胞的HLA-C2配体结合,使NK细胞功能异常发生不利于妊娠的免疫反应,可能是引起URSA发病的免疫遗传学因素之一。进一步分析KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白水平的表达有可能为不明原因复发性流产的免疫遗传机制带来新的思路。

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