降脂消斑片对兔动脉粥样硬化模型主动脉与冠状动脉粥样硬化斑块的影响

程丑夫 ，邱赛红 ，程 屹 ，刘建和 ，龙 云 ，漆相和

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；3.岳阳相和化工科技有限公司，湖南 岳阳 410208）

降脂消斑片是根据湖南省名中医程丑夫教授多年临床实践探索、总结获得的治疗高脂血症及动脉粥样斑块有效的经验方而开发的中药新药。该药由虎杖、黄芪、大黄、当归等药物组成。具有化痰清热，活血通脉，调节血脂，消退动脉斑块功效。主治痰热血瘀之高脂血症、动脉粥样斑块形成。经初步的临床观察，证明该方在调节血脂，促进动脉粥样斑块消退方面有较好的临床疗效，且较长时间服用未见对机体有明显不良影响。为了了解降脂消斑片调节血脂、治疗动脉粥样硬化的药理作用,并对其作用机制进行探讨,本项目研究采用兔制备动物高脂血症合并动脉粥样硬化模型,证实模型成立后，在继续给予高脂饮食同时，观察了降脂消斑片对此种动物模型的主动脉与冠状动脉粥样硬化斑块的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康大耳白兔，雄性。由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号：湖南省医学实验动物管理委员会医动字20-003号。实验动物环境设施合格证号：湘医动字20-001号。动物进入实验室后，兔为单笼喂养。动物室光照充足，通风和空调设备良好。空调保持室温18～25℃，相对湿度50%～70%，实验室按常规定期清洁、消毒。兔用基础饲料由湖南中医大学动物实验中心按标准配方制备后提供。

1.1.2 药物 降脂消斑片：采用不含辅料的干浸膏粉。每1 g干膏粉含生药5.12 g。降脂消斑片推荐的每日临床用量为20.6 g生药/d（长沙华源医药科技公司提供，批号：060920）。辛伐他汀片：10 mg/片。适应于高脂血症。临床常用量为10～20 mg/d（上海信谊万象药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字Z19980054，生产批号060902）。脂降宁片：主要有山楂、制何首乌、氯钡酸铝等，功能行气散瘀、活血通经、益精血、降血脂，主治胸痹心痛、眩晕耳鸣、肢体麻木、高脂血症，或合并高血压、冠心病、动脉硬化等的高脂血症。 0.4g/片，临床用量为 3～4片/次，3次/日（辽宁康博士制药有限公司生产,批准文号：国药准字Z19994081，生产批号 20060901）。

1.1.3 试剂 胆固醇（含量≥90%，淮北市创凯生化原料厂，批号：20060729）；蛋黄粉（安徽亳州红日实业有限公司，批号：060706142）；现炼猪油为本地农贸市场所购；牛血清白蛋白（含量>98%，北京迪尔拜生物公司生产）；苏丹红Ⅳ （CR级，湖南湘中精细化学品厂生产，批号：20050216）；其余化学试剂均为市售AR级。

1.1.4 仪器 TF-1000型电子天平 （湘仪天平仪器厂生产）；FA104型电子分析天平 （上海精密科学仪器有限公司生产）；754型分光光度计 （上海第三分析仪器厂生产）；LEICA DM LB2型双目显微镜 （德国LEICA公司生产）；MIAS医学图像分析系统（北京航空航天大学科学仪器厂生产）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立[1-3]（1）高脂饲料配方及制备 高脂饲料配方参照文献介绍:胆固醇2%，猪油10%，蛋黄粉20%,基础饲料68%。将猪油加热溶解后,与胆固醇、蛋黄粉加入基础饲料中拌匀，用饲料制粒机压制成颗粒即可。（2）模型制备 健康日本大耳白兔，雄性，体质量1.5～1.9 kg。参照文献方法,采用血管内皮免疫损伤加高脂饲料喂养方法制备家兔高脂血症合并动脉粥样硬化模型。动物称质量、编号后，除留作正常组的动物外，其余动物造模第1天和第7天,每只动物分别从耳静脉注射牛血清白蛋白，每次剂量均为250 mg/kg。同时开始以所制备的高脂饲料哺养。方法为每只动物每日上午给予高脂饲料50 g（含胆固醇 1 g，猪油 5 g，蛋黄粉10 g，基础饲料 34 g）。 下午给予普通基础饲料100 g。隔日喂养青菜叶50 g。自由饮水。

1.2.2 动物分组 至造模8周后，经随机从模型组中抽检动物，证实已有高脂血症及主动脉明显粥样斑块形成，此时将全部动物禁食14 h后从耳缘静脉取空腹血测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，作为给药前的血脂结果。造模动物按胆固醇高低分层，随机分为6组。即：模型组(蒸馏水)、降脂消斑片高、中、低剂量组（下称高、中、低剂量组）和阳性对照辛伐他汀与脂降宁组。每组11只。

1.2.3 给药方法及剂量 给药方法采用灌胃给药。模型组和正常组给蒸馏水，其余各组分别给予相应浓度药液。降脂消斑片高、中、低剂量组分别按 0.78、0.39、0.19 g/kg以降脂高中低剂量组给予降脂消斑片干膏粉药液（分别相当于生药量 4、2、1 g/kg），脂降宁 0.6 g/kg、辛伐他汀 2 mg/kg为阳性对照组。给药体积均为10 mL/kg。每天1次，连续8周。每周称体质量1次，根据新体质量调整给药量。各造模动物继续同法给予高脂饲料喂养，直至试验结束。降脂消斑片推荐的每日临床用量为生药20.6 g/d。实验所用干膏粉每克含生药5.12 g，相当于干膏粉4.02 g。降脂消斑片药效学实验设高、中、低3个剂量组。将人用剂量按体质量及体表面积法折算，作为动物试验用药的依据。降脂消斑片及对照药兔用药剂量见表1。

表1 降脂消斑片对兔药物剂量的设置

1.2.4 主动脉及心脏组织病理学检查 主动脉病理学检查：取主动脉弓约1.5 cm用10%甲醛溶液中固定。常规石蜡包埋后切片，HE染色。在光学显微镜下观察主动脉壁形态结构。并采用MIAS医学图像处理系统进行主动脉内膜、斑块厚度与中膜厚度测定。

1.2.5 心脏组织病理学检查 取心脏组织常规石蜡包埋后切片，HE染色后在光镜下进行病理学检查。观察各组心脏组织形态结构。按文献[4]方法进行冠状动脉病变程度分析。并观察记录50个冠状小动脉血管内有脂质者数目，按下式计算冠状小动脉粥样斑块发生率（IA）：

附：冠状动脉病变程度判断标准。0级：动脉内膜无脂质浸润；0.5级：内膜有轻度脂质浸润；1级：内膜斑块占血管腔面积的1/4；2级：内膜斑块占血管腔面积的1/2；3级：内膜斑块占血管腔面积的1/2以上；4级：斑块几乎堵塞整个管腔。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS 13.0 for Windows软件进行处理。计量资料均以“±s”表示。计量组间比较采用T检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

造模后8周时，分别从正常组和模型组随机抽取动物剖检观察，结果，正常对照组动物血脂正常，主动脉内膜平整、光滑，肝脏为棕褐色。造模动物总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)较正常对照组显著升高。且主动脉内膜有乳白色的脂质粥样斑块。苏丹红Ⅳ染色后，主动脉弓、胸主动脉及各分支开口处可见凸起于内膜表面的斑块被染为腥红色。肝脏为棕黄色。表明家兔高脂血症及动脉粥样斑块均已形成。故进行分组、给药。试验过程中，造模组和正常组均有部分动物死亡。其中造模动物注射牛血清白蛋白后次日有个别动物死亡。造模早期个别动物因拒食高脂饲料衰竭而死，部分动物因灌胃操作不慎造成死亡，其余死亡的动物均有腹泻症状，观察均可见肛门污秽，剖检胃肠明显胀气。给药前动物死亡数共有23只，给药后共有14只。各组死亡动物数无明显差异。

2.1 降脂消斑片对兔主动脉及心脏组织病理学的影响

对主动脉进行组织病理学检查结果，正常组主动脉壁厚度较均匀，内膜结构完整。内皮细胞无损伤、脱落。内皮下无脂质沉积。模型组主动脉管壁厚度不一。内膜表面凹凸不平。可见明显的粥样斑块形成，呈新月状或圆弧状向内膜凸起。内皮细胞损伤、脱落，内膜增生。内膜下可见大量泡沫细胞和少量细胞碎片。中膜平滑肌细胞呈不规则增生。各药物治疗组的上述病变均有不同程度的减轻。其中以降脂消斑片高、中剂量组和辛伐他汀组病变程度的减轻最为明显。其内膜相对较平整、内皮细胞受损较轻、内膜下泡沫样细胞堆积程度明显减轻。其余各药物组的病变程度也有较大的改善。采用MIAS医学图像分析系统分别从各标本斑块最厚处测量，测定斑块最大厚度和中膜厚度，并计算内膜、中膜比值。结果，各药物治疗组的斑块厚度和内膜/中膜比值与模型组比较均有显著性差异。提示各药物均有减轻内膜粥样斑块形成的作用。结果见表2。

表2 降脂消斑片对兔主动脉斑块程度的影响 （±s）

表2 降脂消斑片对兔主动脉斑块程度的影响 （±s）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较☆P<0.01。

组 别正常组模型组辛伐他汀高剂量组中剂量组低剂量组脂降宁组剂量（g/kg）— —0.002 0.78 0.39 0.19 0.60 n 898981 1 10 PA（%）0 62.08±14.56☆36.46±12.88**35.74±6.20**37.81±13.08**40.22±10.01*48.35±11.36*最大斑块厚度(μm)17.2±2.0 149.5±31.7☆75.7±27.1**67.3±17.4**75.2±15.8**90.1±18.7**99.4±40.5**内膜/中膜0.09±0.01 0.71±0.19☆0.36±0.15**0.34±0.13**0.36±0.10**0.43±0.11**0.47±0.19*

2.3 降脂消斑片对兔冠状动脉病变程度及冠脉AS发生率(IA)的影响

取心脏组织切片后进行光镜下组织形态学观察结果，正常对照组各级冠状动脉均管壁厚度均匀，内膜光滑、结构完整。内皮细胞无损伤。内膜下脂质沉积。模型组冠状动脉及分支管壁增厚。冠脉内膜增生和泡沫细胞堆积，粥样斑块呈半月形或不规则丘状向管腔突出，使管腔狭窄。多数挤占管腔面积的1/2以上，甚至管腔闭塞。按文献[3]介绍的冠状动脉病变分级标准，病变程度均在2级以上。冠状小动脉粥样斑块发生率IA达69%。各药物治疗组均可不同程度减轻冠脉的脂质浸润和粥样斑块程度，冠状动脉病变计分减少。降脂消斑片和辛伐他汀的作用均较模型组有显著差异。0.39 g/kg以上降脂消斑片及辛伐他汀组降低模型动物冠状小A粥样发生率IA的作用也有显著性，降脂消斑片的作用随剂量加大而增强结果。见表3。

3 讨论

模型的制备是药物研究中的重要环节。家兔是最常用于制备高脂血及As模型的动物，至今仍被广泛采用。其优点是对外源性胆固醇吸收率高，对高血脂的清除能力低，病变发展快而广泛，可复制出与人相似的As病变。研究[5]证实，给家兔高脂饲料喂养的同时，静脉注射异种蛋白牛血清白蛋白造成动物血管内壁免疫损伤，较单纯高脂喂养所形成的AS更明显，造模4周即形成严重的AS。粥样硬化斑块面积高达50.7%。因而该法目前在相关研究中被广泛应用。本实验中采用了免疫损伤加高脂饲料喂养的复合方法制备家兔的高脂血症合并AS复合模型。

表3 降脂消斑片对兔冠状动脉病变程度及冠脉AS发生率(IA)的影响 （±s）

表3 降脂消斑片对兔冠状动脉病变程度及冠脉AS发生率(IA)的影响 （±s）

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较☆P<0.01。

组 别正常组模型组辛伐他汀组高剂量组中剂量组低剂量组脂降宁组剂量（g/kg）——0.002 0.78 0.39 0.19 0.60 n 898981 1 10冠状动脉病变程度0 0.5 1 2 3 4 8 0 0 0 0 0 0 0 0 4 2 3 0 1 4 2 1 0 0 1 5 2 1 0 0 1 3 3 1 0 0 1 3 4 3 0 0 1 2 3 4 0冠脉病变计分0 2.89±0.93☆1.43±0.82**1.39±0.78**1.56±0.82**1.95±0.96*2.05±0.95 IA（%）0 69.1±6.9☆45.0±7.4**44.2±5.1**47.0±6.4*51.8±7.0 50.6±4.4

中医古典医籍中没有“高脂血症”和“动脉粥样硬化”之名，但有关于类似病变及临床表现的论述。按其临床表现，高脂血症合并As属于中医学“痰浊”、“血瘀”的范畴。系本虚标实之病。本虚主要是气虚、阳虚、血虚、阴虚及肝肾不足。标实主要为痰凝、血瘀。治疗宜痰瘀同治，辅以扶正[6]。近年来，随着认识的不断深入，针对炎症贯穿于AS始终的病理特征，一些学者逐渐重视清热解毒类药物的使用[7-9]，并认为可能是中医药防治的重要靶点[10]。降脂消斑片在治则上兼顾痰、瘀、热、虚，旨在通过化痰清热，活血通脉，促使血脂下降、动脉斑块消退。其立法和组方具有良好的中医药理论基础，是其能获得临床疗效的重要依据。

研究结果显示，采用降脂消斑片治疗后，此种模型的主动脉与冠状动脉粥样斑块、及血管内膜的脂质浸润程度均较模型组有明显的减轻。表现为主动脉粥样斑块面积减少、斑块厚度变薄；心脏组织冠脉血管出现粥样斑块的病变数量减少、程度减轻。表明降脂消斑片还具有抑制由高脂血症所造成的动脉粥样斑块发生发展的作用。

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