青蒿琥酯对UUO模型大鼠肾脏的抗炎作用及其机制研究*

马行一,吴蔚桦,曾 燕,马云霞,米绪华

(四川大学华西医院肾脏内科 640041)

抗疟疾药物有效成分青蒿素由中国药学工作者于1971年分离成功,后又在此基础上开发双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥脂等衍生物[1]。新近发现青蒿素类药物还有抗纤维化、抗肿瘤、抗炎等作用。在本研究的前期研究中,通过应用青蒿琥脂干预UUO大鼠,也发现其可降低 UUO大鼠模型肾间质CTGF和α-SMA的表达并呈剂量依赖性[2]。本研究在原有工作基础上,进一步采用左侧输尿管结扎大鼠模型,观察青蒿琥脂干预动物模型的抗炎作用,探讨青蒿素类药物在肾脏病领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性Wistar大鼠90只,4～6周龄,体质量(200±20)g,购自四川大学华西实验动物中心。随机分为假手术组(SOR组)、模型组(UUO组)、青蒿琥酯小剂量治疗组(SDA组)、青蒿琥酯大剂量治疗组(HDA组)和氯沙坦组(ARB组)。

1.2 试剂及主要设备 青蒿琥酯片(50 mg/片)、氯沙坦钾片(50 mg/片)、注射用苯唑西林钠。兔抗大鼠磷酸化NF-Kappa B多克隆抗体(ser276)(cell signaling#3037)、兔抗大鼠Smad 7多克隆抗体(武汉博士德BA1399)、HRP标记羊抗兔IgG(北京中山生物技术公司)、Trizol(美国,BRC)、RNA提取试剂盒(QIAGEN)、反转录试剂(立陶宛 MBI)、dNTP(Promega)等。DNA Engine OpticonTM实时荧光定量PCR仪(美国M J Research公司)。

1.3 引物与 Taqman探针序列 Taqman探针5′端标记的FAM为荧光报告基团,3′端标记的TAM RA为荧光淬灭基团。引物及探针序列见表1。

1.4 动物分组及造模型 动物适应喂养后,按照前期实验方法[2]制备(UUO)动物模型,SOR组除不结扎离断输尿管外,其余同UUO组。从术后24 h开始,HDA、SDA组分别给予青蒿琥酯50 mg◦ kg-1◦ d-1、25 mg◦kg-1◦ d-1灌胃,ARB组给予氯沙坦钾20 mg◦kg-1◦d-1灌胃,SOR组和 UUO组给予等比例生理盐水灌胃。术后第3、7天随机处死各组大鼠6只。取右肾组织,部分保存于Carnoy′s固定液中,用于 HE、Masson染色和免疫组织化学检测;部分液氮快速冷却以提取mRNA。

表1 PCR引物及探针序列

1.5 主要观察指标和方法

1.5.1 大鼠处死前心脏取血检测血肌酐水平。

1.5.2 HE染色、Masson染色观察一般病理变化,电镜观察肾脏组织细胞变化。

1.5.3 免疫组织化学染色检测磷酸化NF-Kappa B 本研究采用SP法检测磷酸化NF-Kappa B的P56亚基核转移的情况。染片后在光镜下选择10个连续不重复视野(×1 000倍),以光镜下细胞核被染成棕黄色为核阳性细胞。计数各视野中核阳性细胞数量,取平均值为该片核阳性细胞数,结果以(核阳性细胞数/HP)表示。

1.5.4 实时荧光定量 PCR法检测各组 Smad 7和 Iκ B-α的mRNA表达 将Trizol法提取的组织RNA用紫外分光光度计测定浓度后,取总RNA进行逆转录反应。采用DNA Engine OpticonTM实时荧光定量PCR仪以30 μL反应体系进行PCR扩增。采用β-actin为内参照。读取待测目的mRNA进入指数增长期的循环数记为CT值,经内参校正后与SOR组比较,求出样本针对SOR组的相对拷贝数,即以待测标本基因表达与SOR组基因表达的倍数关系进行数据统计分析。

1.6 统计学方法 运用SPSS13.0统计软件包处理。组间差异比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况及血生化指标 实验开始前,各组大鼠体毛、色泽正常无明显差异,尾部红润,正常进食,活动灵敏,对声响、光等刺激反应迅速,机敏,生长正常,大小便无异常表现。行造模手术后,各组手术大鼠出现不同程度活动减少,进食减少,毛色暗淡。造模手术各组实验大鼠血肌酐水平均有不同程度升高,以UUO组明显。不同时点观察,各治疗组大鼠血肌酐水平无明显差异,见表2。

2.2 各组大鼠肾组织病理表现 SOR组HE染色各时间点未见肾脏有明显异常;UUO术后3 d可见远端小管扩张,上皮细胞轻度浊肿、空泡变性,肾间质轻度水肿,间质内有散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润,肾小球结构正常;UUO术后第7天可见肾小管上皮细胞肿胀变性,部分细胞嗜酸性变,部分肾小管灶性萎缩,管腔轻度扩张,管腔内见蛋白管型及上皮细胞管型,肾小管间质稍增宽,其间可见成纤维细胞轻度增生及少量淋巴细胞为主的炎细胞浸润。电镜下见 UUO大鼠细胞内溶酶体增多,胞浆内可见大小不等的空泡,内质网及线粒体组织改变不显著,见图 1、2。

表2 UUO模型各组血肌酐变化(mmol/L)

图1 肾脏病理7 d标本(×400)

图2 UUO大鼠肾组织电镜下表现(×10 000)

表3 NF-Kappa B阳性细胞计数(个/HP)

2.3 NF-Kappa B P65阳性细胞分析 P65阳性细胞SOR组散在可见,随着各组UUO造模时间延长,P65阳性细胞数显著增加,以小管细胞核阳性多见。各治疗组与UUO组在术后3、7 d比较阳性细胞数各治疗组显著少于 UUO组(P＜0.05),以HDA组减少最为明显(P＜0.05),见表 3、图3。

2.4 PT-PCR检测 按所述反应体系进行45个循环,根据所检测样本进入基因对数倍增期所得循环数读取CT数值,其中Iκ B-α合成片段全长143 bp,Samd 7合成片段全长184 bp。统计分析可见Iκ B-αmRNA在造模后表达明显下降,其中 UUO组下降最为明显(P＜0.05),Smad 7的 mRNA表达上升高,药物干预组Smad 7水平显著高于 UUO组(P＜0.05),见表 4、5。

图3 NF-Kappa B阳性细胞染色(×1 000)

表4 Iκ B-α相对拷贝数计算

表5 Smad 7相对拷贝数计算

3 讨 论

病理性的炎症过程贯穿于各种急慢性肾损伤的全过程,是各种常见肾脏疾病造成组织结构及功能损害的重要途径。肾脏的炎症发生过程复杂,与多种细胞信号传导通路及细胞因子关系密切。炎症过程所导致的结果表现形式多样,包括肾纤维化损伤、新月体形成、肾小球系膜细胞凋亡损伤过程中,均伴随有形式多样的病理炎症状态作用。目前炎症作为发病机制已见于多种肾脏疾病[3-5]。有效的抑制炎症过程的发生已经成为各种肾脏病新药开发的共同靶点。

本研究所选取的青蒿琥酯药理作用及药代学明确[1],以往作为一种经典抗疟疾药物使用,新近发现其还有抗寄生虫、抗炎等作用[6-7],在肾脏病领域研究目前还处于起步阶段,本研究所选择的观测指标核因子NF-Kappa B在炎症过程的发生中居于核心地位。本文所检测的P65亚基为其中的一个重要功能亚基,在蛋白酶水解NF-Kappa B抑制物后进入细胞核内,启动炎症过程;本文所检测的另一指标Iκ B-α就是一种起重要作用的NF-Kappa B抑制物。由于NF-Kappa B的mRNA表达水平并不能反映NF-Kappa B整个功能水平,所以本研究并未进行P65的mRNA水平检测。

本研究所采用的单侧输尿管结扎大鼠模型成功复制了肾脏疾病的炎症发生,电镜照片也证实这点。从研究结果看青蒿琥酯能有效抑制NF-Kappa B通路的表达,干扰 Iκ B水解而起到抗炎作用,同时也发现青蒿琥酯能上调另一类重要抑制性Smad蛋白——Smad 7的表达。以往对 Smad 7的研究主要局限于其对TGF-β1表达通路的抑制。新近发现 Smad 7可以调控多个与炎症相关的信号传导。已有研究发现上调Smad 7表达,可以在UUO大鼠模型及大鼠新月体肾炎模型体现出较好的抗炎效应[8]。由此可见,青蒿琥酯的抗炎效应部分可能是通过上调Smad 7表达所致。

总之,青蒿琥酯有良好的抗炎效应,可以改善UUO模型大鼠炎症过程的发生,有一定的潜在临床价值。

[1]戴小军,刘延庆,梅全喜.蒿属药用植物药理活性研究进展[J].中药材,2005,28(3):243.

[2]米绪华,栾森,曾燕.青蒿琥酯对UUO模型大鼠肾组织CTGF和α-SMA表达的影响[J].西部医学,2007,19(3):332.

[3]Eric G,Neilson,William G,et al.免疫肾脏病学[M].2版.大连:辽宁科学技术出版社,2006:283.

[4]Chung CP,Oeser A,Solus J,et al.Inflammatory mechanisms affecting the lipid profile in patients with systemic lupus erythematosus[J].J Rheumatol,2007,34(9):1849.

[5]Nelson CL,Karschimkus CS,Dragicevic G,et al.Systemic and vascular inflammation is elevated in early IgA and type 1 diabetic nephropathies and relates to vascular disease risk factors and renal function[J].Nephrology Dialysis T ransplantation,2005,20(11):2420.

[6]刘成伟,陈雅棠,李文桂.扫描电镜观察双氢青蒿素对大鼠体内卡氏肺孢子虫表面形态的影响[J].重庆医学,2004,33(6):838.

[7]Li WD,Dong YJ,Tu YY,et al.Dihydroarteannuin ameliorates lupus symptom of BXSB mice by inhibiting production of TNF-alpha and blocking the signaling pathway NF-kappa B translocation[J].Int Immunopharmacol,2006,6(8):1243.

[8]Huang XR,Chuang AC,Zhou L,et al.Latent TGF-beta1 protects against crescentic glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(2):233.