急性缺血再灌注大鼠脑中γ-氨基丁酸A型受体α1mRNA的表达变化

张俊清 王 伟 薛 钢 孙智敏

包头医学院第一附属医院神经内科 包头 014010

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性氨基酸,在神经元损伤中与主要的兴奋性递质谷氨酸(Glu)相抗衡。GABA可阻断Glu兴奋性毒性,抑制细胞膜去极化和Ca2+内流,具有神经保护作用。介导GABA中枢效应的受体至少有三种不同类型,即 GABAA、GABAB、GABAC受体,其中以GABAA受体分布最为广泛,在缺血性脑损伤的神经保护中占主导地位。哺乳类大脑中天然GABAA受体主要是由α、β和γ亚基组成。其中α亚基对GABAA受体复合物的组装及功能可能起主要作用。α1与β2和γ2组成的GABAA受体亚型在脑内数量最多,尤其在海马和大脑皮质最为丰富,约占全部GABAA受体的43%。对GABAA型受体α1亚基基因的研究,目前多集中在癫[1]、抑郁症[2-4]等方面,在缺血性脑血管方面研究甚少。本研究以线栓法建立大脑 MCAO模型,采用原位杂交技术对大鼠脑组织中GABAARα1mRNA进行检测,来观察γ-氨基丁酸A型受体基因在脑缺血再灌注损伤中的动态变化规律及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 健康Wistar雄性大白鼠55只,体质量260～310g,由内蒙古大学动物试验中心提供。将动物随机分为:正常对照组,脑缺血 2h 再灌注 6h、12h、24h、3d、7d组(手术组)及假手术对照组,每组5只。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作:采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO),大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于鼠台,碘伏消毒后颈部正中切口,暴露右颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉近心端,血管夹夹闭颈内动脉,在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线,在颈总动脉近分叉处剪一约0.3mm小口,将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26mm,长50mm)经小口处插入,沿颈内动脉入颅,进线深度由分叉处算约20mm,稍感阻力时停止,此时已至大脑中动脉起始处,以活结结扎用于固定鱼线的结扎线,缝合手术切口,缺血2h后将线栓抽出,松开颈总动脉上的活结造成缺血再灌注模型,假手术对照组除不插鱼线外,其余步骤同缺血组。

1.2.2 标本取材和石蜡切片制作:分别在上述规定时间点,给予大鼠10%的水合氯醛0.5ml腹腔注射麻醉,剪开胸腔经左心室快速输入0.9%氯化钠注射液,同时剪开右心耳,待血色变淡后快速输入4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有1/1000DEPC)固定脑组织,待鼠颈及四肢僵硬后,停止灌注,快速断头取脑置于 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含有 1/1000DEPC)固定保存。取视交叉前后约4mm厚脑组织经常规脱水、浸蜡、包埋。石蜡切片连续冠状切片,42℃温水展开,片厚 6μm,将石蜡切片贴于涂有多聚赖氨酸的切片上,置于60℃烤箱内过夜,放4℃冰箱待用。

1.2.3 原位杂交过程:①石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。②暴露mRNA核酸片段:切片上滴加1ml3%柠檬酸,100ul新鲜稀释的胃蛋白酶混匀,37℃或室温消化10min,原位杂交用PBS洗5min×3次,蒸馏水洗涤3次。③预杂交:干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20ul加预杂交液。恒温箱42℃4h。吸取多余液体,不洗。④杂交:按每张切片20ul杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱42℃杂交过夜。⑤杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次;37℃0.2×SSC洗涤 15min×1次。⑥滴加封闭液:37℃30min。甩去多余液体,不洗。⑦滴加生物素化鼠抗地高辛:37℃60min,原位杂交用 PBS洗5min×4次。⑧滴加SABC:37℃20min,原位杂交用PBS洗 5min×3次。⑨滴加生物素化过氧化物酶:37℃20min,原位杂交用PBS洗5min×4次。⑩DAB显色:使用 DAB显色试剂盒,1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴,混匀,加至标本上。显色20min,充分水洗。⑪苏木素复染,充分水洗。⑫酒精脱水,二甲苯透明,封片PBS洗3次×5min。蒸馏水洗1次。

1.2.4 观察项目和统计学处理:在400倍显微镜视野下计数各组脑组织海马区及大脑皮层GABAARα1mRNA阳性神经元数及观察GABAARα1mRNA分别在相应海马区及大脑皮质阳性神经元表达的改变。采用江苏捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析,每张切片随机选取10个高倍视野,测量原位杂交的阳性神经元数目。采用SPSS 13.0软件进行统计处理,各组数据用均数±标准差()表示,所用统计学方法用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性细胞计数比较 与正常对照组相比,假手术对照组GABAARα1mRNA的表达无明显改变(P＞0.05),但与正常对照组及假手术对照组比,脑缺血2h再灌注24h海马区及大脑皮质GABAARα1mRNA的阳性神经元数目减少,3d降至最低(P＜0.05),14d基本恢复正常水平(P＞0.05)。

表1 大鼠海马区GABAARα1mRNA的阳性神经元细胞数比较(个/每视眼)

表2 大脑皮质GABAARα1mRNA的阳性神经元细胞数比较(个/每视眼)

2.2 组织形态学改变 光镜下正常对照组和假手术组神经元形态学无异常,阳性细胞胞浆着色呈棕黄色;手术组海马区及大脑皮层部分神经元结构表现出坏死前样改变,包括细胞核浓缩、胞浆着色变淡、细胞结构不清,尤其在再灌注24h及3d时为著,缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶,灶内神经元残存较少甚至缺失。

3 讨论

数十年来,人们对急性缺血性脑卒中病理生理机制的研究越来越深入,这应归功于脑缺血模型的制备。大鼠由于具有与人类脑血管相似的解剖基础及侧支循环情况、生理参数易控制性、价格低廉易得到而被广泛用来作为缺血动物模型的制作。目前,研究应用最多的是血管内线栓法造成MCAO局灶性模型。该模型无需开颅,对机体损伤性小,形成梗死灶较恒定,不会影响其他血管供血区域的局部脑血流量,且能控制缺血时间,形成有效再灌注。一方面,MCAO模型与人类临床常见的单一动脉,尤其是大脑中动脉闭塞一致,能较好模拟基底节区梗死;另一方面,人类大脑中动脉梗死常有自发性再灌注情况,MCAO模型通过线栓拔出实现血液再通,能够满足这一需求。因此,MCAO局灶性脑缺血模型被广泛用于神经元对缺血的敏感性、耐受性以及再灌注损伤病理机制和药物干预治疗等方面的研究。本研究以线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,缺血2h再灌注不同时间点,大鼠不同程度的表现有缺血对侧肢体功能瘫痪的神经功能缺失现象,证明了模型制作成功。

有研究显示[5],短暂性脑缺血后,GABAA 受体α1、α2亚单位mRNA呈双相变化。缺血早期发生再灌注后1h,主要表现为CA1和CA3区锥体细胞和颗粒细胞上mRNA表达降低;缺血晚期时,CA3区细胞mRNA表达开始恢复至对照水平,而在CA1区两种mRNA的表达仍较低,可持续到缺血后第3天,与CA1区锥体细胞分布一致。而Elena Alekseevna Kharlamov等[6]研究显示,光化学诱导血栓性脑梗死后,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降明显,30d开始上升,说明缺血损伤后,其代偿机制具有复杂的时间依从性,GABAARα1mRNA在梗死后7d下降,可能由于 mRNA转录水平下降或者是mRNA稳定性下降导致。本研究结果显示,脑缺血2h再灌注24h时,GABAAR α1mRNA含量降低,3d时降至最低,推测,GABAARα1mRNA含量的变化与脑缺血再灌注损伤有关。与先前的研究相比较,GABAAR α1mRNA含量降低及恢复正常的时间段不同,这可能与所采用的试验方法与技术以及缺血模型制作方法不同有关。

本试验应用原位杂交技术充分证实大鼠脑缺血再灌注24h～3d时脑组织中GABAARα1mRNA的表达降低,提示缺血再灌注后GABAAR α1mRNA转录受阻或其稳定性下降所致。若利用碱基配对原则人工合成氨基酸,作用于GABAAR α1mRNA转录过程,减轻脑缺血后再灌注损伤,可能达到脑保护作用。

[1]Brooks-Kayal AR,Shumate MD,Jin H,et al.Coulter DA(1999)Human neuronal-aminobutyric acid A receptors:coordinated subunit mRNA expression and functional correlates in individual dentate granule cells[J].J Neurosci,1999,19:8312-8318.

[2]Brambilla P,Perez J,Barale F,et al.GABAergic dysfunction in mood disorders[J].Mol Psychiatry,2003,8:721-737.

[3]Tunnicliff G.Malatynska E.Central GABAergic systems and depressive illness[J].Neurochem Res,2003,28:965-976.

[4]Zul Merali,Lisheng Du,Pavel Hrdina,et al.Dysregulation in the suicide brain:mRNA expression of corticotropin-releasing hormone receptors and GABA A receptor subunits in frontal cortical brain region[J].Journal of Neuroscience,2004,24(6):1478-1485.

[5]Li H,Siegel RE,Schwartz RD.Rapid decline of GABAA receptor subunit mRNA expression in hippocampua following transient cerebralischemia in the gerbil[J].Hippocampus,1993,3(4):527.

[6]Elena Alekseevna Kharlamov,Kathy Louise Downey,Peter I-saac Jukkola.Expression of GABAA receptor α1subunit mRNA and protein in rat neocortex following photothrombotic infarction[J].Neuroscience,2008,19:29-38.