酶联免疫斑点试验检测技术在血液病合并痰涂片抗酸杆菌阴性结核病诊断中的应用

叶丽萍, 梁 艳, 施 兵, 刘丽辉, 金建刚, 张玉珠, 胡文清, 刘明娟,阳幼荣, 陈 虎, 吴雪琼

2.全军结核病研究所;

3.军事医学科学院附属医院造血干细胞移植中心。

结核分枝杆菌是一种细胞内寄生菌,抗结核免疫主要是细胞免疫,由于血液病患者自身免疫功能低下,应用化疗或免疫抑制剂治疗导致骨髓抑制,使机体免疫功能进一步下降,易合并各种感染,特别是结核分枝杆菌感染。血液病患者患结核病时的临床症状不典型,而传统的诊断结核病的检测方法,大多数呈阴性反应,使医师凭经验给予诊断性抗结核治疗,可能给患者增加了药物不良反应的风险。近年来国内、外用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测免疫功能低下患者合并活动性结核,有很好的敏感性及特异性[1-4]。因此,近2年来我们用全军结核病研究所研制的ELISPOT试剂盒,通过检测外周血中分泌IFN-γ的单个核淋巴细胞,以传统的诊断方法为对照对我科2006年6月—2008年10月间住院的415例血液病患者,其中105例发热痰涂片抗酸杆菌阴性怀疑合并活动性结核的患者,进行了检测,并对105例中临床确诊的24例结核患者及27例排除结核的患者共51例的临床资料进行了回顾性分析,现报道如下。

材料与方法

一、观察对象

检测了105例发热痰涂片抗酸杆菌阴性怀疑合并活动性结核的患者,非血液病、临床及检验结果不全、中性粒细胞低(＜1.0×109/L)或血标本有凝块、操作失误等因素排除后,分析了51例。确诊血液病[5]合并活动性结核[6]的患者24例,其中男16例、女8例,中位年龄40岁(11～70岁),有结核病史的9例,1例急性白血病患儿有结核病密切接触史;24例中恶性血液病17例,其中急性白血病12例[急性髓细胞白血病(AM L)5例中3例M2型、2例M4型,急性淋巴细胞白血病(ALL)5例,混合型2例,其中各含1例AML-M2型同胞移植后4年及PH+ALL无关供者移植后2个月发生结核病]、慢性髓细胞白血病(CML)急变1例、骨髓增生异常综合征(MDS)1例、淋巴瘤(NHL)2例(1例弥漫大B细胞型Ⅲ期B、1例免疫母T细胞型Ⅳ期)、1例多发性骨髓瘤(MM)IgG型Ⅲ期A;良性血液病例7例其中骨髓纤维化1例、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)3例(糖皮质激素治疗3年与5年各发生1例)、再生障碍性贫血(AA)2例(含1例异基因移植后29 d)、1例系统性红斑狼疮(13年溶血性贫血史长期服糖皮质激素)(见表1)。27例排除活动性结核的患者：男19例、女8例,中位年龄40岁(14～77岁),3例有结核病史,恶性血液病22例(2例有呼吸衰竭)：急性白血病 9例、CML5例(移植后 2例)、2例 MDS、NHL1例、MM 4例、慢性淋巴细胞白血病(CLL)1例;良性血液病5例：纯红细胞再生障碍性贫血及贫血各2例、Castleman病1例。

表1 24例血液病合并结核病患者一般情况Table 1.General clinical data of the 24 patients with hematologic diseases and tuberculosis

二 、方法

(一)ELISPOT 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴细胞分层液分离、提纯外周血单个核细胞(PBMC),调节细胞浓度至2.0×106/L。取一预包被IFN-γ捕获单克隆抗体的微孔板,每个测试样本需要微孔板3孔：阴性对照孔内加入完全细胞培养液50 μ L,阳性对照孔内加入阳性对照 PHA 50 μ L;在测试孔内分别加入CFP10-ESAT6融合蛋白50 μ L。分别在上述各孔内加100 μ L含有 2×105个PBMC的悬液,将微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20 h;弃上清液,用200 μ L ×PBS 洗板4次,每孔加入50 μ L 1∶60稀释的IFN-γ检测抗体,37℃孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L 1∶1 000稀释的链亲合素-碱性磷酸酶,室温孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L新鲜配制的 BICP/NBT底物,显色 15 min;可见板底显示紫色斑点,用蒸馏水洗板中止反应。每1个点代表1个分泌IFN γ的T细胞,应用CTL公司酶联斑点分析仪计数着色的斑点。当阴性对照孔点数＜8,检测孔点数减去阴性对照孔点数≥8,可判断所检测标本为阳性;如果阴性对照孔点数≥8,检测孔点数为阴性对照孔2倍,可判断所检测标本为阳性。

(二)结核菌素皮肤试验 左前臂1/3处内侧皮内注射0.1 mL(5 u)的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD),出现皮丘注射成功,72 h后测量红肿或硬结横纵直径(mm),其平均值作为PPD皮试大小。若硬结的横径及纵径的平均数≥5 mm为阳性。

(三)抗结核抗体检测 取外周不抗凝血2～3 mL,1～2 h后3 000 r/min离心15 min,取上清液用于抗结核抗体检测。联合检测3个抗结核抗体,所用抗原分别为阿拉伯甘露聚糖、结核分枝杆菌活动期产生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。严格按试剂盒提供的步骤操作。检测的血或(和)痰及体液标本≥2项阳性为检测阳性。

(四)活动性结核的诊断标准

1.肺结核：按中华医学会结核病学分会制定的肺结核诊断和治疗指南诊断[6]。

2.肺外结核：①慢性中毒症状有发热、盗汗、消瘦;②PPD试验强阳性或血抗结核抗体≥2项阳性;③体液沉渣涂片抗酸杆菌阳性或结核杆菌培养阳性或抗结核抗体≥2项阳性;④影像学检查具有结核的特点;⑤组织活检病理证实;⑥试验性抗结核治疗有效。凡符合上述≥3项者诊断为肺外结核。

三、统计学方法

数据分析采用t检验;多变量间的相关性用logistic回归软件进行相关性分析。

结 果

一、血液病合并活动性结核的患者结核相关试验结果

临床确诊24例合并活动性结核患者中：PPD阳性6例、阴性5例(用免疫抑制剂13例未查);抗结核抗体检测阳性9例、阴性15例;ELISPOT阳性14例(未查3例)、阴性5例(其中2例淋巴细胞数＜0.5×109/L)(见表2)。PPD阴性的 3例中ELISPOT均阳性,1例 ELISPOT阴性而 PPD阳性;3例ELISPOT阴性患者中抗结核抗体均阳性(2例为淋巴细胞数低);9例抗结核抗体阴性患者中,ELISPOT试验均阳性。

二、血液病排除活动性结核患者其结核的相关试验结果

27例(23/27肺部感染占85.2%)中PPD阴性11例、阳性1例(用免疫抑制剂15例未查);抗结核抗体阴性21例、阳性3例(未查3例);ELISPOT阴性24例、阳性3例(见表2)。ELISPOT假阳性率11.1%,PPD 8.3%及抗结核抗体12.5%,三者差异无统计学意义(见表3);3项均阳性或任意2项阳性的患者均为0。1例PPD阳性患者抗结核抗体及ELISPOT均阴性,3例抗结核抗体阳性患者中2例ELISPOT均阴性,3例ELISPOT试验阳性患者中2例抗结核抗体均阴性。

三、ELISPOT灵敏度、准确度评价

ELISPOT的灵敏度(73.6%,14/19)高于抗结核抗体试验(37.5%,P=0.0047)和PPD皮肤试验(54.5%,P=0.0351);ELISPOT的准确度(82.6%,38/46)高于抗结核抗体(62.5%,P=0.0447)和PPD皮肤试验(77.8%)(见表3)。

四、ELISPOT的特异度、阳性预测值和阴性预测值评价

ELISPOT的特异度(88.9%)与抗结核抗体(87.5%)及 PPD(93.8%)相似;阳性预测值(82.4%,14/17)略高于抗结核抗体(75.0%,9/12),与PPD(85.7%)相似;以上差异均无统计学意义。阴性预测值82.76%,高于抗结核抗体 58.3%(P=0.0421)差异有统计学意义,略高于PPD 75.0%(见表3)。

五、血液病怀疑活动性结核诊断进行logistic回归相关性分析

表2 血液病合并结核病24例及27例排除结核病患者的ELISPOT、抗结核抗体与PPD试验Table 2.The diagnostic results of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in hematologic patients with(24)or without(27)tuberculosis

表3 血液病合并结核患者ELISPOT、抗结核抗体与PPD试验结果比较Table 3.Utility of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in patients with both hematologic diseases and tuberculosis

对51例患者性别、年龄、结核病史或接触史、热型、影像学、血象(特别是淋巴细胞计数)、红细胞沉降率、C反应蛋白、抗结核抗体、ELISPOT、PPD试验、B超及影像学等多因素分析后发现,活动性结核只与ELISPOT、PPD、抗结核抗体、肺CT、结核史 5项相关(见表4)。

表4 对51例血液病怀疑结核诊断数据进行logistic回归相关性分析Table 4.Logistic regression analysis of the factors associated with the tuberculosis in 51 patients with hematologic diseases

讨 论

急性白血病合并结核患病率报道不一,在1.2%～20%以上不等[7]。我国人群中活动性肺结核发病率为367/10万[8],本研究血液病合并活动性结核发生率为24/415(5.7%),约为该发病率的15.5倍,与严云等[9]报道5%相近。24例合并结核病患者中有结核病史9例占37.5%,另有1例为密切接触者。24例中恶性血液病17例占70.83%,初诊时发病7例,治疗后10例,其中2例造血干细胞移植后发病、1例CML加速期发病。17例中肺结核8例,肺外结核9例(累积胸膜8例、心包1例,≥2部位6例)。24例中良性血液病 7例,占29.16%,有 6例长期使用免疫抑制药物(糖皮质激素或CSA、1例为sAA造血干细胞移植后早期发生)、1例初诊时合并。发生肺结核2例、肺外结核5例,均为结核性胸膜炎。良、恶性血液病肺外结核均＞50%。

在27例血液病排除活动性结核的患者中,肺部感染占85.2%(3例有结核病史),病理检查后排除8例,试验性抗结核治疗结合相关试验后排除9例,抗感染治疗(细菌、真菌、病毒)后好转排除其余患者。

由于我组24例患者均为痰涂片抗酸杆菌阴性结核,没有典型的结核病症状,以结核性胸膜炎为主。因自身免疫功能低下,大部分患者长期用免疫抑制剂,PPD试验阴性占多数,同时合并其他感染(细菌、真菌、病毒)10/24(41.66%),患者的全血细胞减少又造成取病理难,不能依据结核病诊断标准确诊(痰涂或培养阳性及病理诊断),使误诊率较高。从本研究结果中就可看出常用的PPD试验(13例用免疫抑制剂而未查)与抗结核抗体试验在此类患者中阳性率低,而ELISPOT较上述2项试验阳性检出率高。

Mahairas等[10]在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列,而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列;RD1编码产生2种蛋白：ESTA-6和CFP-10,这2种蛋白作为特异性抗原刺激机体特异性 T细胞产生IFN-γ。

本研究结果进一步证实了血液病痰涂片抗酸杆菌阴性患者的活动性结核诊断困难,特别是结核相关试验阳性率低;而ELISPOT作为一种新的检测结核的酶免疫学方法,其灵敏度与准确度显著高于传统的试验方法,试验需时少(2 d)、对隐性活动性结核有诊断价值,可排除因接种卡介苗PPD试验阳性的非活动性结核感染的人群;但受淋巴细胞计数及操作者技能等因素的影响。如果ELISPOT与抗结核抗体、PPD试验相联合,可明显提高此类患者结核的诊断率79.2%,临床医师仍需结合影像学、结核病史及抗结核治疗疗效综合判断,可使诊断率提高(≥90%)。总之,ELISPOT是血液病患者合并活动性结核的重要辅助诊断手段。

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