奶牛乳房炎致病菌的分离和鉴定

张桂贤 （临沂师范学院生命科学学院 276005）

我国奶牛乳房炎发病率高达70%～80%[1]。而奶牛乳房炎是造成奶牛业损失最多的一种疾病[2]，。山东作为畜牧大省，奶牛养殖业发展很快，但受到饲养管理水平及疾病防治技术的限制，奶牛乳房炎发病率较高，而目前滥用抗生素的现象十分普通，造成许多病原微生物的耐药性，给乳房炎的治疗带来很大的困难。针对以上原因本试验对临沂市兰山区各养殖户的乳样进行乳房炎致病菌的分离鉴定，旨在为该地区奶牛乳房炎的治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 乳样及采集

乳样来自临沂市兰山区各奶牛养殖户，共采样45份，采样前先用温水清洗采样乳头，再用75%酒精棉消毒乳头，在每次清洗或消毒乳头后均用消毒纸巾擦干，弃去采样乳区的头2把乳，然后采集乳汁约10～l5 ml，挤入灭菌瓶中，帖好标签后及时送检(期间在4℃冰箱保存，待检)。

1.2 试剂及培养基

麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、三糖铁琼脂、兔鲜血琼脂培养基、普通琼脂培养基、65%的氯化钠肉汤等均按文献[3]自配；细菌生化微量鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；乳腺炎诊断液(SMT试剂，自配，配置方法：十二烷硫酸钠20g，草酚蓝20mg，蒸馏水1000ml，调整pH至6.2～6.4)[4]。

1.3 乳房炎阳性乳的检测

在每个平皿中倒2ml乳样，加入等量诊断液，将平皿平置旋转摇动，使诊断液与乳汁充分混合，经10s后观察，根据混合液有无絮状物及沉淀程度来判定结果混合液均匀，流动性好，无絮状物(阴性-)；有少许絮状物或沉淀产生(弱阳性+)；有明显絮状物或沉淀产生(阳性++)；絮状物或沉淀粘集成凝胶状或成凝胶状团块(强阳性+++或++++)[5]。

1.4 乳房炎病原菌的分离培养

将分离出有乳房炎的乳样各取10ml，加入灭菌离心管中做好标记，以2500r/min离心15min，弃去管中上层液体，留取底部沉淀物。将沉淀物分别划线接种于普通营养琼脂、兔鲜血琼脂、麦康凯、伊红美蓝平板，置于温箱37℃培养24h后观察菌落形态特征，选取典型菌落涂片，革兰氏染色，镜检并将其进一步纯化培养。

1.5 乳房炎病原菌的鉴定[6,7,8]

1.5.1 球菌的鉴定 镜检其形态呈球形，多集成堆，在普通营养琼脂和鲜血琼脂平板呈圆、黄色或灰白色菌落，触酶试验和凝固酶试验阳性，即可判断为金黄色葡萄球菌。当镜检呈球形多为链状排列，触酶试验阴性，即可鉴定为链球菌。当细菌CAMP试验阳性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即为无乳链球菌；当细菌CAMP试验阳性，水解七叶苷和马尿酸钠，即为乳房链球菌。

1.5.2 杆菌的鉴定 镜检为革兰氏阴性杆状，在麦康凯琼脂平板上呈粉红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上呈黑色带金属光泽的菌落，在三糖铁琼脂产酸(或产气)，不分解尿素，氧化酶试验阴性和V-P试验阴性即可鉴定为大肠埃希氏菌。

1.6 药敏试验

选用青霉素、氨苄青霉素、先锋V(头孢唑啉钠)、庆大霉素、链霉素、复方新诺明、红霉素、氯霉素、氟哌酸(诺氟沙星)、阿米卡星(丁胺卡那霉素)10种常用药物的药敏试纸采用纸片扩散法[9]对分离菌株做药敏试验，测抑菌圈直径(包括药敏纸片直径)，计算同一类菌不同菌株的平均抑菌直径(当直径<10mm为耐药，10≤直径<15mm时为中度敏感，直径≥15mm为高度敏感。

2 结果

2.1 阳性乳检测结果

乳样经过乳房炎诊断液检测，45份乳样中11份为阴性，34份阳性(其中27份为强阳性)。

2.2 乳房炎病原菌的分离培养及鉴定结果

对34份阳性乳进行系统的细菌分离培养、染色、镜检(结果见图1、2、3)和生化试验鉴定出3种52株细菌，其中大肠杆菌12株、无乳链球菌14株、乳房链球菌20、金黄色葡萄球菌6株，其它株为杂菌。

图1 黄色菌株(金黄色葡萄球菌)镜检结果

图2 灰白色菌株(链球菌)镜检结果

图3 分离菌(大肠杆菌)镜检结果

图4 大肠杆菌药敏试验结果

图5 链球菌药敏试验结果

图6 金黄色色葡萄球菌药敏试验结果

2.3 药敏试验结果

对筛选的病原菌进行药敏试验，结果(见图4、5、6、表1)表明大肠杆菌对先锋V、氯霉素、阿米卡星、复方新诺明高度敏感；链球菌对青霉素、先锋V、庆大霉素、链霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感；金黄色葡萄球菌对青霉素、先锋V、庆大霉素、链霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感。

表1 三种病原菌药敏试验结果(抑菌直径) （mm）

3 讨论

（1）兰山区乳样检测结果表明，链球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，其次是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。药敏试验表明大肠杆菌对先锋V、氯霉素、阿米卡星、复方新诺明高度敏感；链球菌对青霉素、先锋V、庆大霉素、链霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感；金黄色葡萄球菌对青霉素、先锋V、庆大霉素、链霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感。由于抗菌药物的广泛应用和耐药菌株的增多，细菌对常用抗生素的耐药性愈来愈强，给奶牛乳房炎治疗的选择用药带来很大困难，因此对奶牛乳房炎的治疗要有地区针对性，试验表明该地区奶牛乳房炎治疗首选药物为先锋V、氯霉素和阿米卡星。

（2）大肠杆菌性乳房炎是环境因素导致乳房炎的典型例子，链球菌和金黄色葡萄球菌则是通过接触传染导致发病[10]。所以向养殖户普及奶牛科学饲养知识，严格饲养管理，能有效降低兰山区奶牛乳房炎的发病率，为奶牛养殖户挽回不必要的经济损失。

（3）抗生素是奶牛乳房炎治疗的一种普遍而有效的手段，但不能彻底根治乳房炎，其在乳品中的残留对人类健康造成威胁，而中药治疗则避免了抗生素的不足，但因其应用效果不稳定、剂型少、药理作用不完全清晰等缺点[11]，给奶牛乳房炎治疗也带来了一定的限制。因此在奶牛乳房炎的治疗途径上可以考虑中西医结合治疗等以达到最佳治疗效果。

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[4]周庆新,李锦春,雷彬.奶牛隐性乳房炎的病原分离及药敏试验报告

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[5]倪语星,洪秀华. 细菌耐药性监测与抗感染治疗[M].北京:人民军医出版社,2002.

[6]东秀珠,蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[7]陆承平. 兽医微生物学[M]:第3版.北京:中国农业出版社,2001.

[8]路建彪,刘文强.奶牛乳房炎病原菌的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2007,43(1):62.

[9]廖晚珍. 药敏试验的标准化及其进展[J]. 江西医学检验, 1997,15 (4):9-12.

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