生药防风不定芽分化影响因素的研究

2010-06-08韩珊珊贝丽霞陈祥梅

黑龙江八一农垦大学学报 2010年4期

韩珊珊，贝丽霞，陈祥梅

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.淄博市国家高新技术产业开发区招商局）

防风（Saposhnikovia divaricata）为伞形科防风属多年生药用草本植物[1]，由于掠夺式采挖、草原开荒等原因，野生资源遭到严重破坏，造成了野生防风资源逐年减少与药材市场对防风需求量却与日俱增的供求矛盾[2，3]。采用植物组织培养的方法生产药用植物，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势，且组织培养中细胞生长速度比植物正常生长的速度快[4，5]。

目前关于防风的研究主要在植物资源、化学成分、中药鉴定、药理作用和临床应用等方面[6，7]，有关防风的体外培养，有人曾用幼叶诱导愈伤组织分化出根芽[8]，也有人用原生质体培养获得再生植株[9]。但关于培养基、激素组合、光照、愈伤诱导周期和继代培养次数防风植株再生的影响尚未见详细报道。本试验对防风不定芽分化的影响因素进行了系统研究。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2007～2009年，于黑龙江八一农垦大学农学院进行。

1.2 试验材料

供试材料为防风的愈伤组织。愈伤组织来源于实验室前期研究（韩珊珊，2009）[10]：取无菌苗的幼叶，切成0.5～1.0 cm的小方块，置于愈伤诱导培养基上，即MS+NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基对不定芽的分化的影响

在诱导出的愈伤组织继代培养25 d左右时，选择生长旺盛的愈伤组织，切割成直径为0.5 cm左右的方块，分别接种于MS，1/2MS，B5和White基本培养基，研究培养基对不定芽的分化的影响。每处理接种4瓶，每瓶接5块愈伤组织，统计芽高大于0.5 cm的不定芽总数。试验进行3次重复。

1.3.2 激素组合对不定芽的分化的影响

在诱导出的愈伤组织继代培养25 d左右时，选择生长旺盛的愈伤组织，切割成直径为0.5 cm左右的方块，分析细胞分裂素 6-BA（0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 mg·L-1），KT（0.2，0.4，0.6，0.8 mg·L-1）分别与生长素 NAA（0.2，0.4，0.6 mg·L-1）配合使用对防风分化培养的影响。按二因素随机区组设计试验，每处理组合接种4瓶，每瓶接5个愈伤组织，40 d后统计芽高大于0.5 cm的不定芽总数。试验进行3次重复。计算不定芽的分化率，并对分化率进行方差分析。

另一方面，将生长旺盛的愈伤组织接种于同时添加 3 种激素 NAA （0，0.2，0.4，0.6 mgL-1）、KT（0，0.2，0.5，0.8 mg·L-1）和 6-BA（0，1.0，1.5，2.0 mg·L-1）的培养基上，按L16（43）方案做三因素四水平正交试验。每处理组合接种4瓶，每瓶接5个愈伤组织，40 d后统计芽高大于0.5 cm的不定芽总数。试验进行3次重复。

1.3.3 光照强度对不定芽的分化的影响

分别在光照 12 h·d-1，光照强度为 5001 x、10001 x、20001 x、30001 x 和黑暗条件下进行培养，研究光照强度对不定芽的分化的影响。

1.3.4 愈伤诱导周期和继代次数对不定芽的分化的影响

在愈伤诱导培养基MS+NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0上对防风叶片外植体愈伤进行多次继代培养。其他条件相同的情况下，分别在继代培养15、25、35、45 d时转接，研究培养间隔时间对防风出芽分化的影响，每个处理接种30个芽苗，重复2次，接种后观察记录芽的长势。

1.4 数据统计

不定芽分化率=（形成不定芽的外植体数/接种的外植体数）×100%

数据记录分析由DPS3.01软件完成

2 结果与分析

2.1 培养基对不定芽的分化的影响

从表1中可知，MS培养基为最合适的培养基，其芽诱导率最好，芽发生时间最短。B5培养基获得较高的诱导率，芽发生时间仅次于MS，White培养基的诱导率最低，芽发生时间最长。

表1 培养基类型对防风不定芽分化率的影响Table 1 Effects of substrate types on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

2.2 激素组合对不定芽的分化的影响

细胞分裂素与生长素的浓度配比对不定芽诱导有很大的影响，不同的植物间其浓度配比都存在差异。只有适宜的浓度组合，才能获得较高的诱导率并且植株生长健壮。

将生长旺盛的愈伤组织接种到含激素的MS培养基40 d，对两种细胞分裂素6-BA和KT分别与生长素NAA配合使用的二因素随机区组设计试验结果进行分析，见表2和表3。总体来看，不论与哪种细胞分裂素配合，在供试的3个生长素浓度下，随着生长素浓度的升高，防风不定芽的分化率呈现减低的趋势。同时在生长素浓度为0.4和0.6 mg·L-1的条件下，防风愈伤不定芽的分化率随着6-BA浓度的增加而增加，不过高浓度6-BA对不定芽分化的影响较小。值得注意的是，在生长素浓度为0.2 mg·L-1和6-BA为2.5 mg·L-1的配比情况下，防风愈伤的分化率达到最大的53.1%；在生长素浓度为0.2 mg·L-1和KT为0.4 mg·L-1的配比情况下，防风愈伤的分化率达到最大的56.0%。

表2 激素组合配比对防风不定芽分化率的影响%Table 2 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表3 激素组合配比对防风不定芽分化率的影响%Table 3 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表4，表5激素组合的三因素四水平实验对防风不定芽分化形成率的统计分析结果表明：NAA，KT对愈伤组织不定芽的分化作用达极显著水平，其极差分别达到了16.25和10.19；6-BA对愈伤愈伤组织芽分化作用不显著。从实验的16个处理看出：处理6为适合防风愈伤组织芽分化的最佳处理组合，即MS+NAA0.2+KT0.2+6-BA1.0的不定芽分化率最高，达60.1%。

表4 愈伤组织不定芽分化的正交试验方案及结果Table 4 Effects of hormone combination on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表5 愈伤组织不定芽分化的正交试验的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test on callus adventitious bud differentiation

2.3 光照强度对不定芽分化的影响

由表6可以看出：随着光照强度的增加从5001 x到20001 x，愈伤组织产生的芽数增加，丛生芽健壮。但当光强度增加到30001 x，愈伤组织开始褐化死亡，可见光照太强不利于防风愈伤的生长。在光照强度为20001 x，光照时间为12 h的条件下，适合防风愈伤组织分化出苗。

2.4 培养周期和继代次数对不定芽分化的影响

其他条件相同的情况下，培养时间对防风不定芽的质量和再生能力都有很大的影响，继代时间过长或过短都不利于防风芽的分化。由表7可以看出：愈伤继代培养25 d和35 d的防风不定芽分化率相近，都达到60%左右，综合比较继代培养25 d为宜。随着继代次数的不断增加，仍是25 d和35 d为周期的处理防风不定芽的分化率较高。时间过长愈伤老化，褐化，时间过短愈伤分化不完全，都将影响芽分化。然后对25 d和35 d不同培养周期的防风愈伤进行继代次数的分析，发现继代次数以25 d为周期的继代2次、3次差异不显著，从实验成本等综合方面考虑，培养周期25 d、继代次数2次可有效提高防风不定芽的分化。

表6 光照强度对防风不定芽分化率的影响Table 6 Effects of klx on Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate

表7 培养周期和继代次数对防风不定芽分化率的影响Table 7 Effects of culture period and the number of subcultureon Saposhnikovia divaricata adventitious bud differentiation rate