小口径全生物化异种移植血管制备方法的实验研究1)

郭晓亮,王学宁,张顺业,高 进,马晓华

随着冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting,CABG)等多种血管移植手术在外科中的应用,血管移植材料的研究成为人们关注的重要课题。自体血管是目前临床上最为常用和较理想的材料,但来源有限,且常因静脉曲张、畸形、动脉粥样硬化等原因限制其利用,约有30%的患者缺乏可供移植的自体血管[1]。本研究采用脱细胞及肝素处理的方法在短时间内制备小口径全生物化血管材料,从而提供一种新的移植血管来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料 成年犬12只,13.6 kg～18.2 kg,平均体重15.8 kg,雌雄不限,由山西医科大学法医学院提供。抑肽酶(Aprotinin)、核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)、脱氧核糖核酸酶(Desoxyribonuclease,DNase)、曲拉通-100(TritonX-100)均购于美国Sigma公司;1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)硫二亚胺盐酸盐〔1-ethy-3(3-dimethylaminoporpyl)carbodiimide,EDC〕、DHanks液、EDTA(Ethylenediaminetet raacetic acid)均购于上海生物工程有限公司;普通光学显微镜:日本 Nikon公司;S23400N扫描电子显微镜:日本Hitachi公司。

1.2 取材 于山西医科大学法医学院实验室取缺血时间＜30 min的犬双侧颈动脉,含抗生素(青霉素钾1 000 U/mL)的生理盐水冲洗管腔,再轻柔剥离其外层的疏松结缔组织,将所取的血管截成长度为5 cm长作为实验材料,放入4℃Hanks液中。实验分3组:新鲜犬颈动脉(A)组、单脱细胞(B)组和肝素结合处理(C)组。

1.3 支架的制备 脱细胞步骤:将选取的新鲜的犬颈动脉20条,放在 pH 值 8.0,含 0.05 mol/L NaCl、0.02%EDTA 和 100 kU/mL抑肽酶的0.05 mol/L T ris-cl中振荡24 h;放在pH值8.0,含1.5 mol/L NaCl、0.02%EDTA 和100 kU/mL 抑肽酶的0.05 mol/L Tris-cl中振荡24 h;在 pH 值为7.4的Hanks液中清洗4次后放入含1%TritonX-100、0.02%EDTA和100 kU/mL抑肽酶的0.05 mol/L Tris-cl中振荡24 h;在pH值为7.4的D-Hanks液中清洗。以上操作都在4℃下进行;放入37℃,pH 值 7.6,含 DNaseⅠ(10 mg/L)、RNase(1 mg/L)、Mg2+(3 mmol/L)、Ca2+(1 mmol/L)的10 mmol/L的 Tris-cl中消化1 h～2 h;4℃,pH值7.4,含1%TritonX-100的Tris-cl液浸泡 24 h;4℃,pH值为7.4的 Hanks液中浸泡48 h。

肝素处理步骤:将脱细胞后的犬颈动脉随机选取10条,室温下,蒸馏水漂洗3次,每次10 min。再浸入heparin-EDC液(EDC 1.67 g+肝素钠0.835 g+0.05 mol/L HCl 200 mL,pH1.5),室温下,pH值为1.5,振荡48 h。制备好的两组支架材料放入 D-Hanks液中密封包装后,经60Coγ射线25KGy辐照消毒,4℃保存备用。

1.4 组织学观察 分别取3组的血管标本,经10%中性甲醛中固定,石蜡包埋,切取厚度为5 μ m 的切片,分别进行HE染色和 VG染色。取B、C两组标本用甲苯胺蓝(0.05 mg/mL)染色观察肝素结合效果和结合程度。

1.5 扫描电镜观察 分别取新鲜动脉及脱细胞处理后的血管标本,每组标本分别切取5片厚度为1 mm的切片,经2%戊二醛固定,1%锇酸缓冲液处理、脱水、冷冻干燥、喷金后扫描电镜观察。

1.6 机械性能测定 每组取血管标本各5条。纵行切开3组颈动脉标本,室温下用HD-10型厚度仪测量血管厚度和宽度,算出原横截面积(原横截面积=宽度×厚度),应用材料性能试验机(型号:INSRON5544,太原理工大学生物力学实验室)测拉伸负荷(牵拉速度为5 mm/min),计算拉伸强度(拉伸强度=拉伸负荷/原横截面积)、弹性模量、最大载荷、最大变形量和拉伸率;将同组标本中的2段(长约 2 cm)纵行切开,用 7-0Polypropylene缝线作端-端吻合两针,边距 1 mm,针距2 mm,打结固定(至少打7个结以防止滑脱),然后用性能试验机进行单轴拉伸,直至缝线撕脱或断裂,记录最大负荷值,重复6次,以测定血管对缝线的耐受力。

1.7 凝血时间 分别取 B、C两组标本各 6段(长5 cm)浸入PBS液37 ℃保存,分别于脱细胞后 0、3 d、7 d、14 d、21 d取 1 cm×1 cm小块,仔细剥去外膜;再切成4个等大的组织块,置入5 mL的试管中;分别加入2 mL同一只兔耳缘静脉血,立即加橡胶盖,摇动,纪录血凝块出现时间,若超过 1 h不凝,实验停止记为(-)。

2 结 果

2.1 形态学观察 新鲜犬颈动脉弹性好,管腔内膜光滑,全长可达15 cm,口径约3 mm～4 mm,分支少、易游离。脱细胞后血管大体形态无明显改变,仍具有良好的弹性、无塌陷。

2.2 组织学观察 HE染色和VG染色:A组血管壁可见细胞均匀分布,纤维排列致密清晰;B、C两组血管的细胞成分被完全去除,血管支架的细胞外基质成分保留完好,纤维没有发生断裂;与A组相比,B、C两组支架材料的纤维排列较疏松。VG染色结果显示,支架材料的内面可清晰显示完整的内弹性膜结构。甲苯胺蓝染色:B组染色阴性;C组管壁全层染色阳性。

2.3 扫描电镜观察 A组血管内表面覆盖着完整的单层内皮细胞。经过脱细胞处理后,内皮细胞层被完全去除,无残留任何细胞及细胞碎片成分;内表面弹性蛋白完整、规则,为网状排列,并有规则的孔隙结构;单根纤维无明显的膨胀或断裂。

2.4 机械性能测试(见表1)3组的间拉伸强度、最大载荷、最大变形量、拉伸率、缝线耐受力并无统计学意义(P＞0.05),仅B、C两组的弹性模量小于 A组(P＜0.05)。

表1 3组样本的机械性能测试(±s)

表1 3组样本的机械性能测试(±s)

组别 弹性模量(mPa)拉伸强度(mPa)最大变形量(mm)最大载荷(N)拉伸率(%)缝线耐受力(mPa)A 组 28.30±3.67 17.14±1.93 11.25±1.79 10.96±1.53 115.12±14.51 1.38±0.14 B组 23.62±2.561) 16.05±2.26 10.87±1.86 9.69±1.36 107.89±12.65 1.28±0.16 C组 24.28±3.121) 15.80±2.97 11.58±2.19 9.77±2.13 112.91±15.89 1.20±0.22与A组比较,1)P＜0.05

2.5 凝血时间测定(见表2)B组在60 min内均有血栓形成;而C组在60 min内未形成血栓。

表2 两组样本凝血时间

3 讨 论

随着血管移植术的发展,血管移植物的供需失衡已成为亟待解决的问题之一。目前临床上广泛应用的人工血管由于弹性差、顺应性差及易形成血栓等缺点,作为血管移植物,尤其是小口径血管移植物(＜5 mm),尚不能令人满意。理想的血管移植材料都应具有如下条件:①血管壁应具有完整外膜、中膜和内膜三层结构;②具有良好的生物相容性;③具有生物学特性和血管的力学特性[2]。经脱细胞制备的血管支架为一种全生物化材料,完全可以满足这些条件。脱细胞制备的支架材料保持了血管的原有形态和物理性能,并保存了细胞识别的结合位点,可以为细胞的黏附、增殖、分化及功能发挥提供与体内组织发育的细胞外基质(ECM)相似的支架条件[3];且无或极低的免疫排斥反应,构建的血管支架材料也显示出良好的生物相容性和顺应性,通畅率高。

本实验选用机械性能与人血管相似的犬颈动脉,其全长可达15 cm,直径约3 mm～4 mm,并且分支少,解剖结构清晰。脱细胞处理方法我们选用脱细胞效果较好的去污剂-酶消化法[4],实验过程包括含蛋白酶抑制因子的低渗液处理、含Triton X-100、DNase和RNase的高渗液处理。Triton X-10 0是一种非离子型表面活性剂,可以通过其分子上的亲水基团溶解部分细胞及内在的蛋白酶,使细胞内的蛋白酶缓慢释放,从而降低了胶原纤维、弹力纤维的损。Samouillan等[5]研究发现使用Triton X-100和胆盐处理瓣膜组织不影响胶原和弹力纤维结构的稳定性。EDTA属于基质金属蛋白酶抑制剂,它可以抑制蛋白酶的激活,减少了基质结构的破坏和溶解;另外,它还能通过螯合对细胞黏附起重要作用的Ca2+,降低细胞间结合的稳定性,促进脱细胞。脱细胞处理后所制备的血管基质材料主要由胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白(GAG)等组成[6],胶原纤维和弹性纤维能够维持血管的弹性和机械强度,且抗原性低,生物可降解性好;GAG是一种非免疫原性物质,能结合生长因子和细胞因子,对细胞的黏附、迁移、增殖和分化起调节作用[6,7]。这些成分与哺乳动物同源性高,且免疫原性很低,可以避免发生免疫排斥反应。组织学染色和扫描电镜观察显示证实经脱细胞处理后犬颈动脉中的细胞成分被完全去除,保留了完整的细胞外基质成分,管壁的结构没有断裂和破坏,并保持了规则的孔径结构,有利于受体细胞的浸润长入,从而促进支架材料在体内的重塑过程。

如何使制备好的血管支架在移植后仍能保持通畅、防止血栓的形成,是长期以来困扰人们的问题。有研究表明直接将脱细胞后的血管材料植入异体或异种体内后,由于血管内皮细胞被去除,这样的血管支架材料易形成血栓,其远期通畅率很低[8]。肝素具有多种生物活性,抗Xa因子强,抗因子Xa和抗因子Ⅱa比值增加,可以减少并且抑制凝血酶,抗凝作用强而可靠。其抗凝作用早已被应用于许多人工材料(冠状动脉支架、CPB管道等)的制备中,研究者把肝素结合在这些人工材料的表面,证实肝素可以在局部缓慢持久地释放从而发挥其抗凝活性,对于其长时间内皮化过程中的抗血栓有重要的作用[9]。

本实验采用Conklin等[10]报道的EDC交联法,将肝素分子以共价键结合到脱细胞后的血管支架的表面胶原上,进行抗凝修饰,减少胶原蛋白的直接暴露。EDC是一种双功能的交联剂,它既可与胶原中的氨基酸残基交联,又可以将含有碳酸根的有机材料活化,介导其与交联后胶原支架中的游离氨基酸残基的肽键结合,从而将有机材料结合到胶原支架上。采用甲苯胺蓝染色结果显示肝素结合于支架材料全层;体外凝血试验显示经肝素结合后的支架材料有良好的抗血栓形成的能力。并经机械性能测试结果显示,脱细胞和经肝素结合的脱细胞血管支架的力学特性与正常的血管相比几乎没有明显的变化。

本实验证实,利用去污剂-酶消化联合肝素结合法可以制备犬颈总动脉的血管支架材料。所制备的血管支架材料中完全去除了血管的细胞成分,能够完整地保留血管的细胞外基质成分,使支架材料具有与正常血管类似的三维空间结构;经脱细胞及肝素结合后的支架材料的形态、内径没有明显的改变,其力学特性与正常的血管相比几乎没有明显的变化;并且经肝素结合的血管支架材料具有良好的抗血栓形成能力,能够提高远期的通畅率。因此,本实验制备血管支架材料的方法可以作为制备小口径异种移植血管的新方法,能够为后期的动物移植实验提供所需的移植材料。

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