红树林内生真菌K38和E33混合发酵代谢产物研究*

李春远,佘志刚,林永成,周世宁

(1.华南农业大学理学院生物材料研究所，广东 广州 510642；2.中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275；3. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275)

由于海洋环境的特殊性和微生物在生态系统的功能,海洋微生物已发展出独特的代谢方式,并提供了陆生微生物未遇到过的代谢产物。海洋微生物已成为寻找新药先导化合物的新源泉[1]。红树林独特的生理和生态使其成为海洋微生物(特别是海洋真菌)丰富的聚集地,对红树林内生真菌的研究表明,从中有可能找到新的生物控制剂和药物。内生真菌K38和E33分别采集自我国湛江湿地红树植物秋茄叶片及麒麟菜枝干，二者单独发酵的粗提物基本不显示抗菌活性，由于它们在相同培养条件(GYT培养基，室温)下均生长良好，因此对其进行了混合发酵，生测结果表明发酵液乙酸乙酯萃取物对小麦赤霉、香蕉炭疽、荔枝霜疫霉等多种危害农业和水果的病菌显示出较强的抗菌作用。为解释上述现象产生的机制，前期分别系统研究了两株菌的代谢产物，分离得到十多种化合物[2-6]。本研究在上述基础上进一步开展了两株菌混合发酵产物的研究，共分离鉴定了8种化合物，其中deoxyscytalidin(1)，1-甲氧基-2-羟基-3-甲基蒽醌(2)，5-丁基-2-吡啶甲酸甲酯(3)，5-(3-丁烯基)-2-吡啶甲酸甲酯(4)，sescandelin(5)以往未从单独发酵的两株菌中分离到，化合物1,2,3,4为首次从海洋真菌里获得。麦角甾醇、过氧化麦角甾醇及尿嘧啶以往曾在E33菌中分离得到。

1 结果与讨论

化合物1的快原子轰击质谱给出准分子离子峰389[M+H]+，元素分析(w/%)C 67.31%, H 8.20%, N 0, 与理论值C 67.32%, H 8.22%, N 0对比并结合碳谱，推出分子式C22H28O6，计算不饱和度为9。碳谱结合DEPT谱可以看出22个碳中有2个季碳, 2个次甲基碳,10个亚甲基碳和2个甲基碳，δ165.54, 165.34, 165.30, 164.91的季碳提示分子中有4个酯羰基存在, 由于分子没有这么多O, 推测分子中可能存在2个酸酐。δ144.24,143.47, 143.27, 143.25的季碳提示分子中有2个双键存在，剩余的不饱和度表明分子中还有3个环存在，很容易联想到可能有五元的酸酐环存在。1HNMR中δ0.86和0.80 的2个三重峰以及13CNMR中2个CH3和众多CH2的存在，提示分子中可能存在2条烷基链。由此判断出该化合物的结构与以往分离到(-)-byssochlamic acid非常相似[2]，只是2条烷基链的长度不同，对照文献[7]数据基本一致，确定化合物1为deoxyscytalidin。

化合物2为黄色针状晶体，EI-MS谱给出分子离子峰m/z268[M]+，结合氢谱和碳谱，推出其分子式为C16H12O4，计算不饱和度为11。碳谱提示存在9个季碳(其中2个羰基碳)，5个CH，2个CH3。具有典型的蒽醌骨架特征，并解释了所有不饱和度。氢谱中2个甲基均为单峰,从位移值判断δ3.94(s，3H)为甲氧基，2.45(s，3H)为甲基，在δ8.20(1H, m), 8.16(1H, m), 7.79(2H, m)出现的4个芳香质子之间的多重峰及偶合常数，表明它们之间是同一苯环上四个互相处于邻位H。另外在δ7.89(1H, s)是另一个苯环上的H。进一步与文献[8]对照，确证其结构为1-甲氧基-2-羟基-3-甲基蒽醌。

化合物3的快原子轰击质谱给出其准分子离子峰194[M+H]+，结合元素分析推出分子式C11H15NO2。1HNMR中2.69(2H, t, 7.3 Hz), 1.61 (2H, tt, 7.3 Hz), 1.38(2H, qt, 7.3 Hz), 0.94(3H, t, 7.3 Hz)几组H之间的偶和关系，表明分子中的CH3与3个CH2互相连接成一个丁基链。薄层层析展开没有拖尾现象，结合1H NMRδ4.00(3H, s)的活泼H，推测分子中可能有一个甲氧基，剩余的不饱和度提示分子中可能存在一个芳香环，1HNMR中δ8.05(1H, dd,0.5,8.0 Hz), 7.62(1H, dd,2.1,8.0 Hz), 8.55(1H, dd,2.1,0.5 Hz)证明了这一推论。该化合物1HNMR数据与我们以往在K38中发现的5-丁基-2-吡啶甲酸十分相似，由此推测该化合物为5-丁基-2-吡啶甲酸的甲酯化产物。据此查阅文献[9]，对照相关数据基本一致，确定化合物3的结构为5-丁基-2-吡啶甲酸甲酯。

化合物4薄层层析斑点与3类似，1HNMR在低场部分也十分类似，推测可能为类似物。1HNMRδ5.80(2H, ddt, 7.3,16.8 Hz),5.02(1H, ddt, 1.4,8.0,16.8 Hz), 5.01(1H, ddt, 1.4,8.0,10.6 Hz的偶和情况及化学位移表明与3不同的是有一个不参与共扼的末端双键。判断出分子中存在一个丁烯基。由此推测该化合物为5-(3-丁烯基)-2-吡啶甲酸的甲酯化产物。进一步与文献[9]标准数据对照基本一致，证明化合物4为5-(3-丁烯基)-2-吡啶甲酸甲酯。

化合物5是白色粉末状固体，溶解于丙酮中，用硅胶薄层层析展开，在254 nm紫外光下显示很强的荧光斑点。电喷雾质谱显示分子离子峰为221[M-H]+，13CNMR结合DEPT谱可以看出分子中共有11个碳，其中包括3个芳香CH，以及1个CH3和6个季碳,δ65.7是连O的CH。1HNMR显示δ6.50(d, 2.1 Hz, 1H)和δ6.74(d, 2.1 Hz, 1H)是苯上两个间位的H,δ7.43(s, 1H)的H参与了共扼体系。δ11.91高尖峰是和羰基形成氢键的-OH，13CNMR中具有δ167.50左右的碳初步判断是酯羰基。推测该化合物可能是异香豆素类化合物。1HNMRδ9.70(s, 1H),δ4.46(s, 1H)有可能是-OH。δ1.52(d, 7 Hz, 3H)表明分子的CH3是和一个CH连接的，分子中CH只有一个δ65.7，对应1HNMRδ4.86(overlap,1H)表明该H还连有O, 断定该碳可能是和酯羰基O直接连，也可能是连接了一个羟基。由此查阅文献[10]，对照有关物理常数和波谱数据基本一致，确定化合物5为sescandelin。

麦角甾醇、过氧化麦角甾醇及尿嘧啶通过与标准品进行熔点及薄层对照得到确认。

2 实验部分

2.1 试剂与实验仪器

葡萄糖(CP) 、蛋白胨、酵母膏(BR) 、乙酸乙酯(AR)、石油醚(AR)、甲醇(AR)等为市售。结构测定仪器：Bruke 600NB核磁共振仪，VG-2ABB-HS质谱仪, 北京X4型显微熔点仪，BrukerEQUINOX55-A590P3E红外光谱仪，日本岛津公司UV-2501PC紫外-可见吸收光谱仪

2.2 菌种及细胞

真菌E33和K38分别为南海红树林麒麟菜和秋茄内分离出的真菌，种属未定，保藏在中山大学化学学院和生命科学学院。

2.3 菌种发酵培养

同时将两株菌等量接种在培养培养基中，菌种发酵培养基的配比及发酵方法同文献[2]，共培养120 L。

2.4 分离

发酵液过滤, 滤液在50 ℃下浓缩到5 L, 乙酸乙酯提取多次, 合并浓缩乙酸乙酯提取液得提取物50 g。提取物经硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，在φ为8%～12%的梯度下得化合物1(2 mg)、3(5 mg)、4(3 mg),φ为15%～20%梯度下得化合物2(5 mg)。φ为25%～ 30%的梯度下得化合物5(5 mg)。麦角甾醇、过氧化麦角甾醇及尿嘧啶为从菌丝体的甲醇提取液中分离得到。

2.5 化合物的物理和波谱数据

化合物1：C22H28O6，无色针状晶体(2 mg)，θmp(CHCl3)为88～90 ℃；MS(FAB pos)(m/z)/%: 389, 342；1HNMR(600 MHz, CDCl3)δ:3.30 (lH, m), 2.91～2.51(4H, s), 2.25(2H, m ), 1.93(1H, m ), 1.63～1.18 (14H), 0.86(3H, t, 7.2 Hz), 0.80(3H, t, 7.0 Hz)；13CNMR(150 MHz, CDCl3)δ165.54, 165.34, 165.30, 164.91, 144.24,143.47, 143.27, 143.25, 49.99, 34.98, 31.46, 29.11, 28.13, 28.08, 27.14, 27.08, 22.52, 22.41, 13.99, 13.97。

化合物2：C16H12O4,θmp(CH3OH)为220～222 ℃； EI-MS, (m/z)/%: 268[M]+,250,222；1HNMR (600 MHz, CD3COCD3)δ8.20(1H, m), 8.16(1H, m), 7.89(1H, s), 7.79(2H, m), 3.88(3H, s), 6.44(1H, 2.1 Hz), 2.34(3H, s)；13C NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 148.3, 157.1, 133.6, 127.3, 127.4, 134.9, 134.8, 127.8, 184.0, 183.7, 136.0, 134.3, 125.5, 127.0, 62.0, 16.7。

化合物3：C11H15NO2, 无色片状晶体, MS(FAB pos): 194[M+H]+,163; UVλmax/nm(logε): 264(3.39); 225(3.77); IR(KBr)ν/ cm-1:1 724, 1 592, 1 572, 1 313;1HNMR(600 MHz, CDCl3)δ8.05(1H, dd,0.5,8.0 Hz), 7.62(1H, dd,2.1,8.0 Hz), 8.55(1H, dd,2.1,0.5 Hz), 2.69(2H, t, 7.3 Hz), 1.61 (2H, tt, 7.3 Hz), 1.38(2H, qt, 7.3 Hz), 0.94(3H, t, 7.3 Hz), 4.00(3H, s)。

化合物4：C11H13NO2，无色片状晶体, MS(FAB pos): 192[M+H]+,150; UVλmax/nm(logε): 264(3.50); 225(3.89); IR(KBr)ν/ cm-1:1 728, 1 642, 1 572, 1 593, 1 313;1HNMR(600 MHz, CDCl3)δ8.06(1H, d,2.1,8.0 Hz), 7.64(1H, dd,2.1,8.0 Hz), 8.56(1H, d,2.1 Hz), 2.80(2H, t, 7.3 Hz), 2.42 (2H, dtdd, 7.3,8.0 Hz), 5.80(2H, ddt, 7.3,16.8 Hz),5.02(1H, ddt, 1.4,8.0,16.8 Hz), 5.01(1H, ddt, 1.4,8.0,10.6 Hz), 4.00(3H, s)。

化合物5：C11H10O5，白色粉末。θmp189～190 ℃；1H NMR(600 MHz, CD3COCD3)δ：6.73(d, 2.1 Hz, 1H)，6.45(d, 2.1 Hz, 1H)，11.46(s,1H), 7.43 (s, 1H)，4.96(m, 7 Hz, 1H), 4.45(s, 1H),1.52(d, 7 Hz, 3H)；13C NMR(150 MHz, CD3COCD3)δ:24.6, 65.7, 101.3, 103.1, 103.6, 139.5, 143.2, 165.8, 166.9, 167.6。

参考文献：

[1] 林永成. 海洋微生物及其代谢产物[M]. 北京：化学工业出版社，2003.

[2] 李春远, 杨瑞云, 林永成, 等. 海洋真菌K38号代谢产物的研究[J]. 中山大学学报：自然科学版, 2007, 46(1):67-70.

[3] LI C Y, YANG R Y, LIN Y C, et al. A new nonadride derivative from mangrove fungus (strain No. k38) [J]. J Asian Natural Products Research，2007, 9(3)：285-291.

[4] 李春远，佘志刚，林永成，等.红树林真菌E33代谢产物的分离及衍生物的制备[J]. 中山大学学报：自然科学版，2007，46(6)：52-54.

[5] LI C Y, DING W J,SHE Z G, et al. A new biphenyl derivative from an unidentified marine fungus E33[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2008, 44(2) :163-165.

[6] 李春远，丁唯嘉，陈敏,等.来自红树林内生真菌#E33中的一个新的水杨酸衍生物[J]. 中山大学学报:自然科学版, 2008,47(1):121-122.

[7] AYER W A, LU P P, ORSZANSKA H,Deoxyscytalidin and lignicol:new metabolites from scytalidium species[J]. J Natural Products, 1993, 56(10):1835-1838.

[8] 杨世林，杨学东，刘江云. 天然产物化学研究[M]. 北京：科学出版社，2009：670.

[9] CAPASSO R, EVIDENTE A, CUTIGNANO A,et al. Fusaric and 9,10-dehydrofusaric acids and their methyl esters fromFusariumnygamai[J]. Photochemistry, 1996,41(4):1035-1039.

[10] KIMURA Y, NAKAJIMA H, HAMASAKI T, et al. Sescandelin, a new root promoting substance produced by the fungus,Sesquicilliumcandelabrum[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1990, 54(9): 2477-2479.