铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药作用的研究

叶晓林，王沼丹，杨晓波

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 610044； 2.四川大学华西医学中心，四川 成都 610044；3.四川省双流县中医医院，四川 成都 610044）

铜绿假单胞菌是重要的条件致病菌，临床上大量抗菌药物使用导致的耐药性上升，使得治疗铜绿假单胞菌感染十分困难。因此，对临床分离的铜绿假单胞菌耐药性进行有效监测，研究联合用药治疗铜绿假单胞菌引起的疾病，对于合理选用最佳治疗方案具有积极意义。氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQNs）抗菌药物临床用于治疗多种细菌感染，包括呼吸道、泌尿道等感染，随着其广泛使用，耐药性也越来越严重。主动外排系统是导致铜绿假单胞菌耐药的重要原因，其中铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排系统是迄今最具有临床意义的药物外排系统[1-2]。笔者研究了临床分离的铜绿假单胞菌对FQNs的耐药性及其机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：27株临床分离的铜绿假单胞菌分别来自四川大学华西医院传染科，标准株ATCC27853由四川大学华西基础医学院药理教研室保存。

药品及试剂：诺氟沙星（norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、司帕沙星（sparfloxacin，SPLX），均由中国药品生物制品检定所提供。LB（Luria-Bertani）培养基，M-H肉汤培养基（浙江省军区后勤部卫生防疫检验所），MH琼脂平板。质粒提取试剂盒，DNA分子量标准物、Taq酶和dNTP，聚合酶链式反应（PCR）产物纯化试剂盒、总RNA提取试剂盒，两步法RT-PCR试剂盒，为宝生物工程（大连）有限公司产品。碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）购自Sigma公司；其他试剂均为分析纯（上海化学试剂厂）。

1.2 方法

最低抑菌浓度（MIC）的测定：用二倍稀释法[3]测定 MIC。抗菌药物的质量浓度为 0.03，0.062，0.125，0.25 …… 64，128 mg/L，液体培养基中含菌量为1×105CFU/mL。MIC结果判断参照National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）公布的标准，铜绿假单胞菌标准株ATCC27853为质控株。

CCCP对 MIC的逆转作用：在测定氟喹诺酮类药物 MIC的同时，制备含有不同质量浓度的喹诺酮类药物和终质量浓度为20mg/L CCCP的平板，测定CCCP是否对氟喹诺酮类药物的体外抗菌活性有影响。若含CCCP的平板中测得的 MIC比单独使用喹诺酮类药物时相应的 MIC降低4倍或以上，则表明有主动外排机制的存在。

铜绿假单胞菌耐药机制的研究：常规培养，离心收集菌体，提取铜绿假单胞菌染色体DNA、质粒DNA以及细菌总RNA[4]。根据文献提供的序列资料和方法，计算机辅助设计扩增铜绿假单胞菌oprM（GenBank accession number AE004676）和 mexR（GenBank accession number U23763）、qnr （GenBank accession number AY070235）基因的PCR引物[1]。mexR基因扩增，以DNA为模板，产物预计为498 bp片段；条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1 min，退火54℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，进行30个循环后再72℃ 延伸7 min。质粒qnr扩增，以质粒DNA为模板，条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，进行30个循环后再72℃ 延伸7 min，产物预计为338 bp片段。oprM基因扩增，采用两步法RTPCR扩增检测其表达情况，以总RNA为模板，首先反转录，然后进行 PCR扩增，条件为预变性94℃ 5 min，变性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，进行30个循环后再72℃ 延伸7 min，产物预计为244 bp片段。用凝胶回收试剂盒纯化mexR基因扩增产物，373A自动测序仪（Applied Biosystems）进行扩增产物的测序。

2 结果

2.1 耐喹诺酮铜绿假单胞菌的药物敏感试验

5种喹诺酮类药物中没有一种对27株铜绿假单胞菌敏感，且诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星的 MIC不小于64 μg/mL 的菌株数分别为 19，21，22，19，21 株，均出现了比较高的耐药水平。MIC测定结果见表1。

表1 27株铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类药物的药物敏感试验结果[株（%）]

2.2 CCCP对MIC的逆转作用

将27株耐药株进行CCCP逆转作用试验，结果有3株耐诺氟沙星铜绿假单胞菌的 MIC能被CCCP逆转，有4株耐环丙沙星铜绿假单胞菌的 MIC能被CCCP逆转，有5株耐氧氟沙星铜绿假单胞菌的 MIC能被CCCP逆转，有8株耐左氧氟沙星铜绿假单胞菌的 MIC能被CCCP逆转，有4株耐司帕沙星铜绿假单胞菌的 MIC能被CCCP逆转。结果见表2。

表2 CCCP对细菌耐药的影响（MIC，mg/L）

2.3 铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排系统oprM基因及其表达

oprM基因的RT-PCR扩增结果：对临床分离的13号及25号铜绿假单胞菌喹诺酮耐药株（主动外排耐药株）的oprM基因进行了RT-PCR扩增，产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图1A。可见，13号及25号铜绿假单胞菌具有250 bp左右的条带，标准敏感菌株扩增产物量少，说明oprM基因的高表达与细菌的主动外排多重耐药有一定的关系。

MexAB-OprM系统的调节基因mexR基因测定：mexR基因表达结果见图1B。可见，13号及25号铜绿假单胞菌具有500 bp左右的条带。扩增产物测序结果表明，将mexR基因序列与gene bank中accession number U23763铜绿假单胞菌序列相比，25号耐药株在编码66位氨基酸处发生了碱基发生突变的情况（GCC→GTC，Ala→Val），但没有检测到碱基缺失，13号耐药株则没有发现碱基发生缺失和突变的情况。

质粒qnr介导的铜绿假单胞菌耐药分析：质粒qnr基因经PCR扩增后，电泳无条带显示，说明在此次分离的耐药菌株中没有质粒介导的耐药产生。

3 讨论

许多试验结果表明，铜绿假单胞菌临床分离株对喹诺酮类药物的耐药性与喹诺酮类药物在临床上应用的广泛性一致，许多药物呈高水平耐药。此外，成都地区的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物的耐药情况与国内其他地区有相似性。细菌对抗菌药物的耐药存在两种重要的现象，即交叉耐药和多重耐药。本研究结果显示，铜绿假单胞菌对5种喹诺酮药物表现出交叉耐药，而且均表现出高水平耐药。这也是铜绿假单胞菌感染难治的重要原因之一。

许多研究表明，铜绿假单胞菌细胞膜上的多种蛋白具有将抗菌药物主动外排的作用，即细胞膜上存在主动外排系统。CCCP是最典型的质子泵抑制剂，可通过抑制主动外排耐药系统能量来源的质子浓度梯度，从而破坏其主动外排作用，表现为药物在细菌中的蓄积显著增加。本研究结果证实，铜绿假单胞菌对5种喹诺酮类药物耐药有主动外排作用，而且主动外排作用具有一定的特异性和交叉性；对氧氟沙星耐药的13号和25号菌株细胞内药物蓄积量在加入CCCP后有所增加，说明了临床分离铜绿假单胞菌主动外排药物的存在。因此，寻找能够抑制细菌主动外排作用的药物，对于克服细菌耐药具有重要意义。

主动外排系统中，MexAB-OprM外排系统最具有临床意义。OprM蛋白在MexAB-OprM外排系统中起着重要的作用，oprM基因过度表达，导致了铜绿假单胞菌对多种抗生素耐药。本研究显示，oprM基因在耐药菌中过度表达，初步说明耐药与oprM基因高水平表达具有相关性。MexR蛋白是MexAB-OprM外排系统生理条件下转录的阻遏蛋白，mexR基因的突变导致MexAB-OprM去阻遏，从而使细菌获得耐药性。对mexR基因的研究结果表明，存在碱基发生突变的情况，所翻译的蛋白质结构发生变化而失去阻遏蛋白的功能，进而导致MexAB-OprM外排系统的过量表达，产生耐药[5-6]。13号菌株没有出现碱基发生缺失和突变的情况，说明MexAB-OprM外排系统的调控还有其他因素存在。

近年来许多学者发现，存在质粒介导的耐药机制，其中qnr质粒编码的qnr蛋白能阻断喹诺酮类药物对DNA回旋酶的抑制作用，从而引起低水平耐药[7]。本研究中，没有发现qnr质粒介导的耐药，这可能与检测的菌株过少有一定的关系。

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