应用 RAPD技术对我国不同地域红色毛癣菌分离株的遗传多样性研究

鲁莎 鲁长明 吴绍熙 李春阳 沈永年 李希清

(1.中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科,广州 510120;2.中国科学院皮肤病研究所,南京 210042;3.山东大学齐鲁医院皮肤科,济南 250062)

红色毛癣菌是皮肤癣菌病中最常见的致病菌之一,常引起人体局部或泛发性感染。其在培养基上表型包括绒毛状、粉末状等,但表型变异易受多种因素 (如生长环境、多次传代等影响而不稳定)。而基因型较表型稳定,因此用基因分型方法进行流行病学研究具有优势。目前分子生物学技术已广泛应用于病原真菌的分型、鉴定及同源性研究[1-3]。其中,随机扩增 DNA多态性 (Random amplified polymorphicDNA,RAPD)方法具有快速、灵敏等优点,近年的一些研究也证实了其在分子流行病学研究等方面的应用价值。本实验采用该方法对来源于我国不同地域 (江苏南京、山东济南、广东广州),分别代表我国华东、中南及华南的 32株红色毛癣菌临床分离株进行了 DNA多态性分析,试图探讨 DNA型别与地域、表型及感染部位等之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

菌株来源 共收集临床分离的红色毛癣菌 32株 (见表 1),分别来自山东济南 8株,江苏南京 12株,广东广州 12株。其中男性 23例,女性 9例,平均年龄约 35岁。21株菌分离自足部,3株菌分离自躯干,7株菌分离自股部,1株菌分离自手指甲。

表 1 32株红色毛癣菌临床分离株的一般资料及RAPD分型Tab.1 General information and RAPD typing of the 32clinical isolates of Trichophyton rubrum

菌株培养与鉴定 以点接种法接种实验菌株于沙氏琼脂培养基 (SDA)中,27℃培养 10 d后观察菌落形态,并按菌落质地将表型大致分为绒毛状及粉末状;所有菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA),27℃温箱孵育 10d后观察色素生成情况;使用玻片法制作小培养以鉴定镜下形态;如PDA培养后无红色色素生成,通过 rDNA ITS序列分析以进一步鉴定。

1.2 菌株 DNA提取

将鉴定后菌株转种于 SDA,27℃培养 10 d,参照文献方法[4],液氮研磨后使用抽提缓冲液 InSta-GeneTMMatrix(BIO-RAD,美国)提取提取菌株DNA,经紫外分光光度计测量 OD260、OD280及计算 OD260/OD280比值,于-20℃保存备用。

1.3 RAPD分析

选取 Kim等[5]报道的用于红色毛癣菌基因分型的 3个随机引物 (ATGS,5'-ATGGATCSSC-3'、OPAO-15,5'-GAAGGCTCCC-3'、UBC-701,5'-CCCAACAACCC-3'),分别对 32株临床分离株进行 RAPD分析。PCR总反应体系为 50μL:5μL模板 DNA(20～50 ng),4μL dNTP混合物 (2.5 mM,Nippon Gene,Japan),25 pmol引物,1.25 U Taq多聚酶 (5 U/μL,Nippon Gene,Japan),5μL 10×反应缓冲液(Nippon Gene,Japan),加 ddH2O到 50μL。扩增反应程序为 94℃预变性 2 min,94℃变性 1 min,34℃复性 1 min,72℃延伸 2 min,40个循环,最后 72℃延伸 10 min。PCR产物经 2%琼脂糖凝胶 (含 0.5 μg/μL溴化乙锭)100 V,90 min电泳后用凝胶成像系统观察并拍照。图片用 GelCompar software,version 4.0(Applied Maths,Kortrijk,Belgium)进行修整,计算 Jaccard遗传相似系数,并用 Ward法进行聚类分析及构建系统发生树[6]。

2 结 果

2.1 实验菌株表型分型及鉴定

32株临床分离株经培养 10 d后,菌落直径约5 cm菌落,其中分别有 19株菌和13株菌菌落质地呈绒毛状和粉末状表型。小培养镜下形态为典型的泪滴型至棒状小分生孢子。G8、G11经 PDA培养后无红色色素生成,经扩增 rDNA的 ITS区后获得 DNA序列,并通过 GenBank核酸序列库 (http://www.ncbi.nlm.nih/blast)进行序列比对进行分子生物学方法鉴定。32株临床分离株经形态学和 rDNA ITS序列分析后均鉴定为红色毛癣菌。

2.2 RAPD分析

图 1 经引物 OPAO-15扩增的 RAPD结果:M.Marker(100 bp DNA ladder,Takara) 图 2 聚类分析树状图Fig.1 RAPD patterns of primer OPAO-15 Fig.2 Dendritic map of cluster analysis

3个引物分别扩增后,引物 OPAO-15产生的谱型清晰,且能产生多态性条带,利于进行多态性分析,选择其为此次分析的引物。经两次重复后显示引物OPAO-15扩增DNA片段的分子量在200～1500bp间 ,扩增条带约 5-11条 (见图 1)。按其同源性分为三大聚类群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,见图 2),不同地域分离株分布在不同群中。群Ⅰ包括 12株菌,有 7条主要 DNA片段,分别包括广州 5株,南京 5株及济南 2株。Ⅱ群包括 9株菌,有 7条主要 DNA片段,分别包括广州 3株,南京 3株及济南 3株。Ⅲ群包括 11株菌,有 6条主要 DNA片段,分别包括广州 4株,南京 4株及济南 3株。

此外,不同表型的菌株分布在不同群中。绒毛状菌株中有 9株 (占总数的 47%)分布在Ⅰ群中。粉末状菌株中有 7株 (54%)分布在Ⅲ群中,也显示有较高同源性。

再次,不同患者在同一取材部位分离菌株DNA型可不同。如表 1所示,分离自躯干的 3株菌分布在Ⅱ和Ⅲ群中;分离自股部的 7株菌主要分布在Ⅰ群中;来源于足部感染的 21菌株表现出多种基因型,平均分布于三个群中。

3 讨 论

随着分子生物学的飞速发展,近年来已将多种分子生物学技术用于真菌感染流行病学、真菌基因多态性及种系发生关系等的研究,可直接从 DNA水平反映基因本身,对真菌分类鉴定的研究起重要作用。而基因分型方法有助于了解致病菌种间及种内差异,有效获得致病菌分类、系统发生学及有性/无性繁殖关系等信息,已广泛应用于多种皮肤癣菌的遗传多态性研究,也陆续有关于红色毛癣菌相关研究的报道[7-9]。

我们研究发现,来源于三个地域的 32株红色毛癣菌种内差异较大,根据遗传相似性分成三大聚类群,不同地域来源菌株的基因分型分布于三大聚类群中,与成晓茹等[10]研究结果相似,未能体现环境因素对遗传特征的影响。而不同地域来源的菌株可具有相同或相似的基因型,如 N11与G10(分别来源于南京及广州),提示随着人口流动的增加,地域间菌株基因型差异减小,地域内菌株多样性增加。

多项研究表明,同一部位的红色毛癣菌感染可由不同基因型的菌株引起,且同一感染部位可在感染的不同时期分离出基因型不同的红色毛癣菌株,提示感染可能由不同基因型菌株混合感染引起,并可能与病情的发展相关,进而影响治疗效果,同时对复发和再感染的判断有一定提示作用。而我们实验菌株的 RAPD带型与取材部位之间未发现明显的对应关系,不同患者同一取材部位的菌株DNA型可相同,无明显特异性,与陈辉、钟志红等[11,12]研究结果相似。而基因型与表型存在一定相关性,研究发现,各表型约一半或以上集中于一个聚类群中,提示同一表型较不同表型间菌株同源性高,具有不同遗传特征的菌株在一些生长环境等因素影响下及传代过程中,菌株可发生表型特征的改变,表型结合基因型进行分析有利于进行流行病学调查研究。

研究结果表明,RAPD为病原真菌的生物学特性研究提供可能,在流行病学研究方面具有一定价值。另一方面,RAPD存在一定弱点,如可受不同引物、模板浓度、反应条件等因素影响,不同地域间研究存在差异,因此,大样本及多种分析方法的运用更能完善及推动分子流行病学的发展。

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