“439”橘橙小种子离体无菌再生培养试验初报

罗君琴 李丽 聂振朋 柯甫志 徐建国 孙建华

（浙江省柑橘研究所 318020）

“439”橘橙是浙江省柑橘研究所以“温州瓯柑”与“改良橙”为亲本杂交育成的柑橘品种，该品种具有丰产稳产、耐粗放管理、果实风味及贮藏性好等优点，深受橘农喜欢，是一个有发展希望的优良品种，但美中不足的是，“439”橘橙果实的种子较多，在一定程度上限制了该品种的发展。尝试培育无籽“439”橘橙对于进一步改良“439”种性及促进其更好发展意义较大。

目前，获取柑橘三倍体新种质的途径主要有三条：（1）柑橘四倍体品种与二倍体品种杂交育种，筛选获取优良三倍体单株。（2）通过离体培养柑橘幼胚乳组织诱导再生芽，获得三倍体植株。（3）利用柑橘田间自然杂交能产生一定比例的三倍体小种子，通过培育柑橘小种子获取三倍体新种质[1～4]。专家们普遍认为重量为正常种子1/3以下的小粒种子，容易培养获取三倍体植株[1，3]。但天然小种子因胚内贮藏养分少，在自然条件下播种繁殖，很难萌发成苗而获得三倍体植株。本研究旨在利用植株组培手段，研究探索“439”橘橙小种子胚无菌离体培养技术，以克服自然播种繁殖的不足，提高橘橙小种子胚成苗率，为利用天然小种子胚选育“439”橘橙三倍体无籽新种质奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验小种子采自浙江省柑橘研究所本部试验站“439”橘橙结果树，选正常种子重量1/3以下且大小基本一致的橘橙小种子进行离体无菌再生培养试验。

1.2 无菌系建立 将试验小种子装入锥形瓶加洗涤剂搓洗，再流水冲洗30min，尽可能多地去除种子上附着的粘性物质。洗净的种子在超净工作台上转入事先已灭菌好的锥形瓶，用70%酒精处理30s～40s→无菌水冲洗→10%次氯酸钠溶液处理10min～12min→无菌水冲洗，分A、B两组进行接种。A组去内外种皮，取小胚接种于MS培养中；B组小种子不去种皮（含内外种皮）。直接种于MS培养基。接种25d后，观察记录外植体污染情况，50d后观察统计小种子胚芽无菌萌发个数及成苗率。

1.3 初生芽增殖 待“439”橘橙小种子试管幼苗2～3cm高时，切取初生苗茎段接种于各增殖培养基（表2），于温度26℃±1℃，光照12h/d，光强2000lx条件下进行增殖培养，增殖培养以MS为基本培养基，pH为5.8，蔗糖含量25g/L。接种45d后分别观察记录各处理瓶苗新芽萌发数量及新芽生长状况。并计算出各培养基处理瓶苗的增殖倍率。

1.4 增殖苗生根 将部分长势良好、高4cm以上的增殖瓶苗转接到生根培养基处理（表3），培养25d后观察统计各处理瓶苗生根率及根生长状况。

2 结果与分析

2.1 种皮对“439”橘橙小种胚试管无菌萌发的影响 “439”橘橙小种子经过相同的消毒处理后，种胚分去种皮和带种皮两种状态接种于同一批次配制的MS培养基，于26℃±1℃温度，12h/d光照，2000lx光强条件下培养，接种25d后观察记录两处理外植体污染情况，50d后观察统计小种子胚芽无菌萌发个数及成苗率，结果如表1所示。

表1 种皮对“439”橘橙小种胚试管无菌萌发的影响

从表1结果可以看出,相同消毒和培养条件下,带种皮种胚比去种皮种胚容易污染,试验中去种皮种胚接种培养25d后无外植体污染，带种皮种胚培养25d存在15%的污染率。同时，不难发现：带种皮外植体接种后种胚萌发明显比去种皮处理晚，且成苗率低。去种皮种胚接种7d胚芽便开始萌发，而带种皮种胚需39d才开始萌发，这可能与种胚外种皮包裹限制了胚吸收外界营养成分或种皮本身含某种生长抑制成分有关。综上可知，柑橘小种子无菌诱导宜去种皮，以缩短其萌发诱导周期。

2.2 不同激素配比对“439”橘橙茎段再生芽诱导的影响 去种皮小胚无菌培养2周左右，种胚可长至2～3cm高，此时便可切取初代苗茎段进行增殖试验。增殖试验共6个处理，每处理20个茎段。接种后45d,观察记录各处理瓶苗新芽萌发总数、新芽生长状况，同时计算增殖倍率，结果如表2所示。

比较表2中处理1、2、3、4可以得知，BA/NAA激素比例相同时，BA O.1～0.5mg/L浓度范围内,随着激素浓度的增加,增殖倍率提高。但BA O.5mg/L时，萌发的新芽叶色淡绿，长势开始走弱，BA 1.0mg/L时，长势更弱且增殖倍率也开始下降。橘橙茎段再生芽诱导培养基BA使用浓度宜控制在O.1～0.5mg/L范围内。另外，再比较处理1和5、处理2和6，在BA、NAA相同使用浓度下，适当添加GA，可以在一定程度上增加新芽萌发，因此当柑橘茎段再生芽萌发率较低时，可适当添加GA，促成新芽形成。2.3不同生根培养基对“439”橘橙增殖苗的生根效果 当继代苗增殖到一定数量时，挑选长势基本一致、生长良好、高4cm以上的增殖苗进行生根培养试验，生根培养以1/2MS为基本培养基，4个不同激素处理的生根培养基均添加0.3g/L活性炭。接种时切成单株，每处理30株。接种后25d观察统计各处理瓶苗生根率及根生长状况，结果如表3所示。

表3 不同生根培养基对“439”橘橙增殖苗生根影响

从表3中四个生根培养基配方可以看出,“439”橘橙增殖苗在 1/2MS+NAA0.3+IBA0.3培养配方中生根最好,生根率可达83%,其次是1/2MS+NAA0.3配方,生根率80%,继代苗生根效果尚可。比较四个生根培养基配方中激素种类，不难发现，NAA与IBA有协同增效，共同促进生根的作用。

3 小结

3.1 相同消毒和培养条件下，带种皮种胚比去种皮种胚外植体接种易污染、萌发晚且成苗率低，可能与种胚外种皮包裹限制了胚吸收外界营养成分或种皮本身含某种生长抑制成分有关，柑橘小种子无菌诱导宜去种皮，以缩短其萌发诱导周期。

3.2 橘橙茎段再生芽诱导培养基BA使用浓度宜控制在0.1～0.5mg/L范围内,在此浓度范围内,BA/NAA激素比例保持不变时,随着BA浓度的增加,初生芽增殖倍率提高。与此同时，发现BA、NAA控制在合理浓度范围时，适当添加GA，可以在一定程度上促成新芽的萌发。

3.3 在本试验的四个生根培养配方中，“439”橘橙增殖在1/2MS+NAA0.3+IBAO.3培养配方中生根最好,其次是1/2MS+NAAO.3配方。与此同时，发现NAA与IBA有协同增效，共同促进生根的作用。

[1]高峰，张进仁，吴安仁,等.离体培养柑橘小胚获得三倍体植株[J].遗传,1998,10(6)：9～11

[2]祝进，王永清，倪彬.尤力克柠檬小种子离体培养研究[J].安徽农业科学,2007,35(9)：2573～2574

[3]周今华.从本地早小粒种子获得三倍体植株的研究[J].浙江柑橘,1984,(3)：47

[4]陈力耕,胡运权.从二倍体柑橘获得三倍体的研究[J].园艺学报,1981,8(2)：11～13