子宫内膜癌中抑癌基因PTEN突变与微卫星不稳定性的相关性分析

赵岩，刘岿然，张淑兰

（中国医科大学 附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

子宫内膜癌占女性生殖道恶性肿瘤的20%~30%，近年又有上升的趋势，已接近甚至超过宫颈癌的发病率。探讨内膜癌发生、发展的分子生物学特征及其临床病理学意义，可为临床医生对内膜癌的早期诊断、临床处理提供依据。子宫内膜癌中最常见的分子水平改变为：微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和抑癌基因——第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）突变。本研究通过对PTEN第5，第8外显子突变的检测及序列分析与MSI进行相关性分析，旨在找到正常子宫内膜癌变的可能途径。

1 材料与方法

1.1 材料来源

组织标本取自2002-2004年在盛京医院接受手术治疗的患者。子宫内膜癌40例，内膜癌患者均无遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colon cancer，HNPCC）家族史。 年龄 41～75 岁，平均年龄56.40岁。选择同期住院手术的子宫内膜不典型增生患者22例，23例因子宫肌瘤手术患者的正常子宫内膜标本做对照。所有患者术前均未接受放、化疗和激素治疗。

1.2 实验试剂

饱和酚、氯仿、异戊醇为国产试剂。

PCR反应体系、电泳缓冲体系、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵等试剂购于SIGMA公司。

引物：PTEN基因外显子5（正向引物：5′-CTTATTCTGAGGTTATCTTTTTTACC-3′；反向引物：5′-CTCAGATCCAGGAAGAGGA-3′，228 bp）；PTEN 基因外显子 8（正向引物：5′-AGGACAAAATGTTTCACTTT TGGG-3′；反向引物：5′-ACATACATACAAGTCACCAACCC-3′，257 bp）：由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 PCR-SSCP进行PTEN基因外显子5和8的突变检测：

（1）提取新鲜冷冻组织及石蜡包埋组织块DNA

（2）PCR扩增：PCR反应体系为30μl。95℃预变性 5 min→94℃30 s→57℃30 s→72℃1 min，共35个循环。72℃延伸5 min。

（3）电泳：取PCR扩增产物3μl与变性剂1∶5混匀，于98℃水浴变性10 min后迅速置于冰浴5 min。取15μl进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（4）银染显色：存入1Dkodak成像分析系统。

（5）将出现异常条带的DNA扩增产物送上海Invitrogen生物技术有限公司测序。

1.3.2 微卫星不稳定性（MSI）的检测：.

（1）DNA的提取：步骤同前。

（2）微卫星位点的选择：选取D13S175，D10S197，D2S123，D10S215，D10s541，共 5 个位点。

（3）微卫星PCR的扩增和电泳：采用银染法显色，保存图像。癌组织和同一患者的正常组织DNA在同一条件下电泳，若出现完全一致的电泳条带，则MSI阴性；如果二者比较出现条带的移动、缺失或获得额外的条带，为MSI阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS12.0进行χ2检验比较组间的差异和相关分析，P<0.05为有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 抑癌基因PTEN在正常子宫内膜（normal epithelium，NE）、子宫内膜不典型增生（atypical endometrial hyperplasia，AH）、子宫内膜癌（endometrial carcinoma of uterus，UEC）中的突变

23例正常子宫内膜（NE）中无PTEN突变发生；22例子宫内膜非典型增生中（AH）7例（31.8%）发生突变；40例子宫内膜癌中11例（27.5%）发生抑癌基因PTEN的突变，3组之间差异有显著性（χ2=8.630，P<0.05）。NE和AH两组相比差异有显著性（χ2=8.666，P<0.01）；UEC和 AH 两组相比差异无显著性（χ2=0.128，P>0.05）。PTEN 外显子PCR产物见图1，PCR-SSCP 结果见图 2。

2.2 子宫内膜癌临床病理参数与PTEN基因突变的关系

如表1所示，PTEN基因突变与子宫内膜癌的手术病理分期有关（χ2=5.030，P<0.05），在子宫内膜癌中PTEN的突变更倾向于发生在手术分期较晚的病例中。PTEN的突变多发生在病理分化程度较高的子宫内膜样腺癌中。（36例子宫内膜样腺癌中11例发生PTEN突变；4例非子宫内膜样腺癌中发生PTEN突变的为0）。

2.3 抑癌基因PTEN突变的DNA测序

在发生PTEN突变的18例病例中，大多数为碱基的插入和缺失造成的移码突变。在子宫内膜癌中发现2例PTEN突变发生在外显子8的poly（A）区域，所有标本均未见外显子5和8同时发生突变。

2.4 子宫内膜病变中MSI的分析

子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌中MSI发生的频率逐渐升高（2/22，9.09%；8/40，20%），与正常子宫内膜组比较，差异有统计学意义（χ2=5.26，P<0.05）。本研究中所有MSI阳性病例均重复1遍实验，以避免因聚合错误引起的MSI假阳性。发生在子宫内膜不典型增生组中的2例MSI均为病理证实的局灶恶变。5个微卫星位点出现MSI的频率有所不同。其中出现MSI较多的位点是D2S123和D13S175，各有9例在这两个位点发生MSI；出现MSI频率最低的位点为D10S215，仅1例发生MSI。

表1 子宫内膜癌临床病理参数与PTEN基因突变的关系Tab.1 Relationship between PTEN mutations and the clinicopathologicalcharacteristics of UEC

2.5 子宫内膜癌中抑癌基因PTEN突变与MSI的状态

子宫内膜癌中11例PTEN突变阳性，其中MSI阳性的7例，MSI阴性的4例；8例MSI阳性的内膜癌中，PTEN突变阳性的7例，PTEN突变阴性的1例。二者高度相关（χ2=18.06，P<0.01）。

3 讨论

3.1 子宫内膜癌与抑癌基因PTEN

子宫内膜癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤，其发病率逐年上升，严重威胁妇女健康。被大多数学者认同的是将子宫内膜癌分为两型：Ⅰ型为子宫内膜样的子宫内膜癌（EEC），属于雌激素依赖型，占85%，较多见；Ⅱ型为非子宫内膜样子宫内膜癌（NEEC），属于非雌激素依赖型，占15%。其中，Ⅰ型子宫内膜癌中最常见的分子水平改变为：微卫星不稳定性和抑癌基因PTEN突变。

PTEN是1997年发现的一个抑癌基因，在许多肿瘤中均存在突变，子宫内膜癌中PTEN突变率为24.5%~55%［1］，是迄今为止发生突变率最高的肿瘤。PTEN因此被认为是子宫内膜癌的看家基因，人们已经意识到PTEN基因在内膜癌的发生过程中起重要作用，但是其在子宫内膜癌变过程中所起的具体作用及PTEN表达调控机制并不清楚。

Yaginuma等［2］发现 PTEN 的外显子 5，8占突变率60%。PTEN突变方式主要有移码突变、无义突变、缺失、拼接体突变等。已有的研究表明移码突变占总突变率的57%［3］。子宫内膜不典型增生中PTEN突变率为20%~33%［4］。本研究中，PTEN的突变从NE，AH到UEC表达差异有显著性（P<0.05），值得注意的是，在内膜癌癌前病变——子宫内膜不典型增生中，PTEN突变已经有了显著性的改变，同PTEN蛋白表达的结果一致［5］。在转录水平和蛋白水平上，内膜癌和其癌前病变中PTEN的表达和突变均明显不同于正常子宫内膜，说明PTEN的改变发生在侵袭癌之前，PTEN失活可以发生在内膜癌变的早期，PTEN功能受损可能影响AH的发展和（或）促进AH向UEC的发展。本研究只检测了PTEN外显子5、8，有可能不能全面分析所有子宫内膜不典型增生中PTEN的突变情况。

关于内膜癌临床病理参数与PTEN突变之间关系的报道结果不一。本研究发现PTEN基因突变与子宫内膜癌的手术病理分期有关（P<0.05），在子宫内膜癌中PTEN的突变更倾向于发生在手术分期较晚的病例中。PTEN的突变多发生在病理分化程度较高的子宫内膜样腺癌中（36例子宫内膜样腺癌中11例发生PTEN突变；4例非子宫内膜样腺癌中发生PTEN突变的为0），说明抑癌基因PTEN功能丧失多发生在I型子宫内膜癌中，是该类内膜癌中重要的分子事件。

3.2 子宫内膜癌中PTEN突变与微卫星不稳定性之间的关系

抑癌基因PTEN突变和微卫星不稳定性（MSI）是I型子宫内膜癌中最常见的两种分子水平的改变。在HNPCC综合征中MSI阳性的病例PTEN突变率高于MSI阴性的病例，认为二者可能存在相关性。那么，在散发性子宫内膜癌中是否也存在这种相关性，它的分子基础是什么还并不清楚。Wang［6］等在动物实验中发现，伴有PTEN突变的内膜不典型增生小鼠如果合并hMLH1突变很快会发生浸润癌，错配修复基因hMLH1可以促进子宫内膜癌变。

本实验中发现在微卫星不稳定性阳性的内膜癌中发生PTEN突变率高于微卫星不稳定性阴性的内膜癌（87.5%，12.5%，P<0.05）。验证了在I型子宫内膜癌中最常见的两种分子水平的改变——微卫星不稳定性与PTEN突变密切相关的假说。而MSI阳性的散发性子宫内膜癌中MSI的状态与hMLH1的失表达有关［7］。

微卫星DNA重复序列广泛的存在于人类基因组中，如果微卫星影响了某些基因的编码区，它就会导致基因功能的丧失并促进癌变。在本研究发生突变的病例中，有2例DNA测序发现PTEN突变发生在PTEN外显子8的poly（A）区域，可能是错配修复基因功能受损的结果。子宫内膜癌中继发于错配修复基因hMLH1缺失所导致的微卫星不稳定性阳性可以增加PTEN核苷酸重复序列的突变，导致基因失活可能是子宫内膜癌发生的一个途径。其他基因也有类似的报道，在MSI阳性的肿瘤中，经常发生编码重复单核苷酸微卫星序列的突变。如：BAX基因的 poly（G）区域、TEF-beta RII的 poly（A）区域等，这些移码突变被看成是MSI阳性肿瘤形成的多步骤过程的继发事件。因此，PTEN基因Poly（A）区域的突变可以认为是错配修复功能受损后的继发反应，可以促进微卫星突变子显型的发展，这样也就能解释为什么在MSI阳性的子宫内膜癌中，发生PTEN基因的突变率高于MSI阴性的肿瘤。

PTEN突变和微卫星不稳定性是I型子宫内膜癌中重要的分子事件，二者在内膜癌中高度相关。可能存在继发于错配修复基因hMLH1缺失所导致的微卫星不稳定性增加PTEN核苷酸重复序列突变的致癌途径。PTEN突变是内膜癌变过程中的早期事件，可能促进子宫内膜不典型增生向子宫内膜癌的发展。

［1］Tantbirojn P，Triratanachat S，Trivijitsilp P，et al.Detection of PTEN immunoreactivity in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma［J］.JMed Assoc Thai，2008，91（8）：1161-1165.

［2］Yangiuma Y，Yamashita T，Ishiya T，et al.Abnormal structure and expression of PTEN/MMAC1 gene in human uterine cancers［J］.Mol Carcinog，2000，27（2）：110-116.

［3］Dellas A，Jundt G，Sartorius G，et al.Combined PTEN and p27kip1 protein expression patterns are associated with obesity and prognosis in endometrial carcinomas［J］.Clin Cancer Res，2009，15（7）：2456-2462.

［4］Norimatsu Y，Miyamoto M，Kobayashi TK，et al.Diagnostic utility of phosphatase and tensin homolog，beta-catenin，and p53 for endometrial carcinoma by thin-layer endometrial preparations［J］.Cancer，2008，114（3）：155-164.

［5］赵岩，银铎，张淑兰，等.抑癌基因PTEN与错配修复基因hMLH1在子宫内膜癌中的表达及意义［J］.中国实用妇科与产科杂志，2006，22（6）：427-430.

［6］Wang H，Douglas W，Lia M，et al.DNA mismatch repair deficiency accelerates endometrial tumorigenesis in PTEN heterozygous mice［J］.Am JPathol，2002，160（4）：1481-1486.

［7］赵岩，张淑兰，杨清.散发性子宫内膜癌中错配修复基因hMLH1表达与微卫星不稳定性的相关性分析［J］.中华肿瘤防治杂志，2007，14（10）：772-775.